小花棘豆Alternaria oxytropis内生真菌苦马豆素合成代谢中酵母氨酸还原酶基因的影响

发布时间：2020-12-19 02:51

　　小花棘豆Alternaria oxytropis内生真菌可合成苦马豆（Swainsonine,SW）,SW是一种有毒的吲哚里西啶生物碱,牲畜过量采食含SW的小花棘豆会中毒,给畜牧业带来严重的损失。真菌中SW合成代谢途径尚未清晰,酵母氨酸还原酶是该途径的关键酶之一,Alternaria oxytropis内生真菌酵母氨酸还原酶基因（sac）在SW合成代谢途径中起重要作用。课题组前期体外培养出小花棘豆野生型内生真菌OW7.8,获得了基因缺失突变株M1,并构建了该基因功能互补载体（pBARGPE-Sac）。本研究以小花棘豆Alternaria oxytropis内生真菌野生株OW7.8和酵母氨酸还原酶基因缺失突变株M1为研究对象,在液体培养基中培养内生真菌,提取菌丝及发酵液中的SW,利用高效液相色谱-质谱联用法（HPLC-MS）检测SW含量;探索了不同培养时间下实验组（添加酵母氨酸）和对照组（不添加）中SW合成动态变化,进行统计学分析;验证sac互补载体后,将其转化至M1的原生质体,经再生和抗性筛选得到sac基因功能互补株,利用PCR技术检测其sac,用反转录PCR（RT-PCR）检测sac... 

【文章来源】：内蒙古师范大学内蒙古自治区

【文章页数】：54 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
中文摘要
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1 引言
    1.1 小花棘豆内生真菌研究概况
    1.2 苦马豆素
        1.2.1 SW的理化性质
        1.2.2 SW的医学价值
        1.2.3 酵母氨酸还原酶基因与SW的生物合成
    1.3 基因互补实验
    1.4 研究目的与意义
2 材料与方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 实验菌株及载体
        2.1.2 试剂与药品
            2.1.2.1 常用试剂
            2.1.2.2 常用溶液的配制
        2.1.3 引物
        2.1.4 主要仪器设备
    2.2 研究方法
        2.2.1 液体培养基中内生真菌菌丝及其发酵液中SW含量测定
            2.2.1.1 内生真菌的培养
            2.2.1.2 SW的提取
            2.2.1.3 SW含量的测定
        2.2.2 酵母氨酸还原酶基因功能对内生真菌SW合成动态的影响..
        2.2.3 酵母氨酸还原酶基因功能互补株的构建
            2.2.3.1 互补载体（pBARGPE-Sac）的验证
            2.2.3.2 缺失突变株M1原生质体制备与互补载体的转化
        2.2.4 酵母氨酸还原酶基因功能互补株的检测
            2.2.4.1 互补株sac的PCR检测
            2.2.4.2 互补株总RNA的提取
            2.2.4.3 互补株cDNA合成
            2.2.4.4 sac基因RT-PCR检测
            2.2.4.5 hph基因RT-PCR检测
        2.2.5 互补株中SW含量的检测
3 结果与分析
    3.1 液体培养基中菌丝及其发酵液中SW含量的测定
    3.2 酵母氨酸还原酶对内生真菌SW动态合成的影响
        3.2.1 内生真菌SW含量测定
        3.2.2 内生真菌中SW合成动态变化的统计学分析
    3.3 酵母氨酸还原酶基因功能互补株的构建
        3.3.1 sac功能互补载体（pBARGPE-Sac）的验证
        3.3.2 缺失突变株原生质体的制备与载体pBARGPE-Sac的转化
        3.3.3 酵母氨酸还原酶基因功能互补株的检测
            3.3.3.1 互补株sac的PCR检测
            3.3.3.2 总RNA的提取
            3.3.3.3 互补株sac的RT-PCR检测
            3.3.3.4 互补株hph的RT-PCR检测
        3.3.4 互补株、OW7.8和M1中SW含量检测
4 讨论与结论
    4.1 讨论
        4.1.1 液体培养基菌丝体及其发酵液中SW含量
        4.1.2 酵母氨酸对内生真菌SW合成动态影响
        4.1.3 酵母氨酸还原酶基因功能互补株的构建与验证
    4.2 结论
参考文献
致谢
作者简介
资助项目


【参考文献】：
期刊论文
[1]疯草内生真菌研究进展[J]. 梁妍,宋向东,谢宗秀,刘宇,郝宝成,王震,王保海,梁剑平.  动物医学进展. 2020(09)



本文编号：2925112