猪轮状病毒VP7蛋白在Sf9昆虫细胞中的表达及应用
发布时间：2020-12-20 20:16
猪轮状病毒（Porcine Rotavirus,PoRV）是引起仔猪腹泻的重要病原之一,主要引起仔猪急性腹泻、呕吐、脱水。猪轮状病毒一般不引起成年猪发病,可以使成年猪呈现隐性感染,持续排毒,从而导致病毒水平传播。若与猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）以及致病性大肠杆菌混合感染会使病情加重,导致高死亡率,从而给养猪业造成严重的经济损失。A群轮状病毒（RVA）属于一种无囊膜包被的病毒,它由11个分节段的双股正链RNA组成,分别编码6个结构蛋白（VP1-VP4,VP6-7）和5/6个非结构蛋白（NSP1-5/6）。VP7和VP4蛋白能够诱导产生血清型特异性中和抗体,在免疫保护和疫苗开发方面起重要作用,至今已在人类和动物中确立了 27个G血清型和37个P血清型。猪轮状病毒最常见的基因型组合为G3、G4、G5、G11和P[6]、P[7]的基因型组合。先前鉴定的在猪中主要的G血清型是G3,G4,G5和G11,与之相关的P血清型是P[6]和P[7]。本研究通过构建PoRV-VP7基因在杆状病毒表达系统中表达的rBacmid-PoRV-VP7融合蛋白,制备了针对rBacmid...
【文章来源】：扬州大学江苏省
【文章页数】：80 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图３－１最佳封闭液和最佳封闭时间的筛选??Ｆｉｇ．?３－１?Ｔｈｅ?ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｂｅｓｔ?ｂｌｏｃｋｉｎｇ?ｓｏｌｕｔｉｏｎ?ａｎｄ?ｏｐｔｉｍｕｍ??
４９??分别设置封闭时间为ｌｈ、２ｈ和３ｈ采用棋盘法进行试验，阴、阳性对照分别使用Ｓ？细??胞培养上清进行１：１００稀释，各设立２个重复。结果如图３－１所示，５％脱脂乳和８％?ＲＳ的??封闭效果相近，２％?ＢＳＡ的封闭效果最好，因此确定最佳封闭液为２％?ＢＳＡ；当以２％?ＢＳＡ??作为封闭液时，封闭时间为２ｈ时，阳性血清与阴性血清的ＯＤ４５〇ｎｍ值相差最大??（Ｐ／Ｎ＝１３．９８９）。因此，确定本研宄方法的最佳封闭液为２％ＢＳＡ，最佳封闭时间为２ｈ。??１６０００?１３．５９３?１３．９８９?１３．８３８??１４．０００?—－??１１．３３１??１２．０００?１１．４４８??１０．０００?１１了３８?＿￣???Ｍ?１０．０３０??ｚ?８．０００???２％ＢＳＡ??－６．０００?—??８％兔皿清??４．０００??２．０００??０．０００??ｌｈ?２ｈ?３ｈ?封闭时间??图３－１最佳封闭液和最佳封闭时间的筛选??Ｆｉｇ．?３－１?Ｔｈｅ?ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｂｅｓｔ?ｂｌｏｃｋｉｎｇ?ｓｏｌｕｔｉｏｎ?ａｎｄ?ｏｐｔｉｍｕｍ??３．２．３待检血清最佳稀释度的确定??使用上述确定条件包被并封闭酶标板，将阳性血清和阴性血清分别用ＳＳ细胞培养上??清按照不同稀释度进行稀释，每个稀释度设置２个重复，其余步骤均按照２．２．１的ＥＬＩＳＡ??操作方法进行试验。结果如图３－２所示，当血清稀释度为１：２００时，阳性血清与阴性血清??的ＯＤ４５Ｇｎ
??ＨＲＰ－羊抗猪ＩｇＧ酶标抗体反应时间??图３－４ＨＲＰ－羊抗猪ＩｇＧ?（Ｈ＋Ｌ）最佳反应时间的确定??Ｆｉｇ．３－４?Ｔｈｅ?ｏｐｔｉｍａｌ?ｒｅａｃｔｉｏｎ?ｔｉｍｅ?ｏｆＨＲＰ－ｇｏａｔ?ａｎｔｉ－ｐｏｒｃｉｎｅ?ＩｇＧ?（Ｈ＋Ｌ）??３．２．６底物最佳反应时间的确定??根据上述确定的条件进行ＥＬＩＳＡ实验。待ＨＲＰ－羊抗猪ＩｇＧ酶标二抗反应结束后，??按照１００（ｘＬ／？Ｌ加入新鲜配制的商品化ＤＡＢ显色液，显色时间分别为１０ｍｉｎ、１５ｍｉｎ、２０ｍｉｎ、??３０ｍｉｎ、４５ｍｉｎ、６０ｍｉｎ；每个显色时间分别做２个阴、阳性猪血清的重复；然后立即用２Ｍ??Ｈ２Ｓ〇４终止反应，读取ＯＤｔ５〇ｎｍ值，结果如图３－５所示，当显色时间为１５ｍｉｎ时，阳性血??清与阴性血清的ＯＤ４５〇ｎｍ值相差最大（Ｐ／Ｎ＝１４．０３６）。因此，确定最佳显色时间为１５ｍｉｎ。??
【参考文献】：
期刊论文
[1]猪轮状病毒病的流行病学、临床表现、病理变化及防控措施[J]. 李子石. 现代畜牧科技. 2017(10)
[2]重庆市2014—2015年部分腹泻发病猪场猪轮状病毒血清流行病学调查[J]. 罗炼钊,龙安格,田成林,陈健勇,杜永新,冯培峰,张云贵,马鲜平,唐明霞,易华山. 中国动物检疫. 2016(10)
[3]轮状病毒疫苗研究进展[J]. 牟迪,夏伟,朱子健,张宇辉,朱庆虎. 养猪. 2016(04)
[4]猪轮状病毒的分子流行病学研究进展[J]. 姜晶,吴丹,李男. 吉林畜牧兽医. 2015(04)
[5]猪轮状病毒的疫苗研究现状[J]. 卓秀萍,黄山,朱玲. 猪业科学. 2014(10)
[6]仔猪感染猪轮状病毒的鉴定及基因分析[J]. 苏雪,侯怡轩,王康,虞凌雪,程群,谢春,姜一峰,杨志彪,李云章,童光志,周艳君. 中国动物传染病学报. 2014(02)
[7]我国猪病毒性腹泻的诊断与流行病学调查研究概况[J]. 杨丽梅,马力,徐倩倩,王艳,张颖,郭时金,沈志强,王艳萍,张志美. 动物医学进展. 2014(02)
[8]猪轮状病毒L1株VP7基因克隆及序列分析[J]. 陈晓春,王继文,吴华伟,蔡青秀,邓永,高金源,郎洪武. 中国兽药杂志. 2014(01)
[9]猪A群轮状病毒的分离与鉴定[J]. 库旭钢,张坤,刘羽茜,何启盖. 畜牧兽医学报. 2012(02)
[10]鸭坦布苏病毒抗体间接ELISA检测方法的建立[J]. 姬希文,闫丽萍,颜丕熙,李国新,张七斤,李泽君. 中国预防兽医学报. 2011(08)
硕士论文
[1]猪传染性胃肠炎病毒TZ-10-2016的全基因序列分析及间接ELISA方法的建立[D]. 王仙.扬州大学 2018
[2]致猪腹泻病毒快速检测方法研究及分子流行病学调查[D]. 汪怿旸.扬州大学 2018
[3]猪轮状病毒GD-01-2015的全基因序列分析及双夹心ELISA方法的建立[D]. 杨娟.扬州大学 2017
[4]抗猪轮状病毒单克隆抗体的制备及双抗体夹心ELISA检测方法的初步建立[D]. 孟柳.东北农业大学 2014
[5]猪轮状病毒VP7蛋白单克隆抗体制备与其抗原表位的初步鉴定[D]. 秦昭恒.东北农业大学 2014
[6]J亚群禽白血病病毒表面糖蛋白SU和兔IgGFc融合蛋白的表达及初步应用[D]. 孙薇薇.扬州大学 2013
[7]猪轮状病毒地方株的分离鉴定及其VP6基因的克隆与原核表达[D]. 陈淑红.东北农业大学 2003
[8]A群猪轮状病毒OSU株VP7基因的克隆及其在杆状病毒中的表达[D]. 徐宏军.东北农业大学 2002
本文编号：2928484
【文章来源】：扬州大学江苏省
【文章页数】：80 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图３－１最佳封闭液和最佳封闭时间的筛选??Ｆｉｇ．?３－１?Ｔｈｅ?ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｂｅｓｔ?ｂｌｏｃｋｉｎｇ?ｓｏｌｕｔｉｏｎ?ａｎｄ?ｏｐｔｉｍｕｍ??
４９??分别设置封闭时间为ｌｈ、２ｈ和３ｈ采用棋盘法进行试验，阴、阳性对照分别使用Ｓ？细??胞培养上清进行１：１００稀释，各设立２个重复。结果如图３－１所示，５％脱脂乳和８％?ＲＳ的??封闭效果相近，２％?ＢＳＡ的封闭效果最好，因此确定最佳封闭液为２％?ＢＳＡ；当以２％?ＢＳＡ??作为封闭液时，封闭时间为２ｈ时，阳性血清与阴性血清的ＯＤ４５〇ｎｍ值相差最大??（Ｐ／Ｎ＝１３．９８９）。因此，确定本研宄方法的最佳封闭液为２％ＢＳＡ，最佳封闭时间为２ｈ。??１６０００?１３．５９３?１３．９８９?１３．８３８??１４．０００?—－??１１．３３１??１２．０００?１１．４４８??１０．０００?１１了３８?＿￣???Ｍ?１０．０３０??ｚ?８．０００???２％ＢＳＡ??－６．０００?—??８％兔皿清??４．０００??２．０００??０．０００??ｌｈ?２ｈ?３ｈ?封闭时间??图３－１最佳封闭液和最佳封闭时间的筛选??Ｆｉｇ．?３－１?Ｔｈｅ?ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｂｅｓｔ?ｂｌｏｃｋｉｎｇ?ｓｏｌｕｔｉｏｎ?ａｎｄ?ｏｐｔｉｍｕｍ??３．２．３待检血清最佳稀释度的确定??使用上述确定条件包被并封闭酶标板，将阳性血清和阴性血清分别用ＳＳ细胞培养上??清按照不同稀释度进行稀释，每个稀释度设置２个重复，其余步骤均按照２．２．１的ＥＬＩＳＡ??操作方法进行试验。结果如图３－２所示，当血清稀释度为１：２００时，阳性血清与阴性血清??的ＯＤ４５Ｇｎ
??ＨＲＰ－羊抗猪ＩｇＧ酶标抗体反应时间??图３－４ＨＲＰ－羊抗猪ＩｇＧ?（Ｈ＋Ｌ）最佳反应时间的确定??Ｆｉｇ．３－４?Ｔｈｅ?ｏｐｔｉｍａｌ?ｒｅａｃｔｉｏｎ?ｔｉｍｅ?ｏｆＨＲＰ－ｇｏａｔ?ａｎｔｉ－ｐｏｒｃｉｎｅ?ＩｇＧ?（Ｈ＋Ｌ）??３．２．６底物最佳反应时间的确定??根据上述确定的条件进行ＥＬＩＳＡ实验。待ＨＲＰ－羊抗猪ＩｇＧ酶标二抗反应结束后，??按照１００（ｘＬ／？Ｌ加入新鲜配制的商品化ＤＡＢ显色液，显色时间分别为１０ｍｉｎ、１５ｍｉｎ、２０ｍｉｎ、??３０ｍｉｎ、４５ｍｉｎ、６０ｍｉｎ；每个显色时间分别做２个阴、阳性猪血清的重复；然后立即用２Ｍ??Ｈ２Ｓ〇４终止反应，读取ＯＤｔ５〇ｎｍ值，结果如图３－５所示，当显色时间为１５ｍｉｎ时，阳性血??清与阴性血清的ＯＤ４５〇ｎｍ值相差最大（Ｐ／Ｎ＝１４．０３６）。因此，确定最佳显色时间为１５ｍｉｎ。??
【参考文献】：
期刊论文
[1]猪轮状病毒病的流行病学、临床表现、病理变化及防控措施[J]. 李子石. 现代畜牧科技. 2017(10)
[2]重庆市2014—2015年部分腹泻发病猪场猪轮状病毒血清流行病学调查[J]. 罗炼钊,龙安格,田成林,陈健勇,杜永新,冯培峰,张云贵,马鲜平,唐明霞,易华山. 中国动物检疫. 2016(10)
[3]轮状病毒疫苗研究进展[J]. 牟迪,夏伟,朱子健,张宇辉,朱庆虎. 养猪. 2016(04)
[4]猪轮状病毒的分子流行病学研究进展[J]. 姜晶,吴丹,李男. 吉林畜牧兽医. 2015(04)
[5]猪轮状病毒的疫苗研究现状[J]. 卓秀萍,黄山,朱玲. 猪业科学. 2014(10)
[6]仔猪感染猪轮状病毒的鉴定及基因分析[J]. 苏雪,侯怡轩,王康,虞凌雪,程群,谢春,姜一峰,杨志彪,李云章,童光志,周艳君. 中国动物传染病学报. 2014(02)
[7]我国猪病毒性腹泻的诊断与流行病学调查研究概况[J]. 杨丽梅,马力,徐倩倩,王艳,张颖,郭时金,沈志强,王艳萍,张志美. 动物医学进展. 2014(02)
[8]猪轮状病毒L1株VP7基因克隆及序列分析[J]. 陈晓春,王继文,吴华伟,蔡青秀,邓永,高金源,郎洪武. 中国兽药杂志. 2014(01)
[9]猪A群轮状病毒的分离与鉴定[J]. 库旭钢,张坤,刘羽茜,何启盖. 畜牧兽医学报. 2012(02)
[10]鸭坦布苏病毒抗体间接ELISA检测方法的建立[J]. 姬希文,闫丽萍,颜丕熙,李国新,张七斤,李泽君. 中国预防兽医学报. 2011(08)
硕士论文
[1]猪传染性胃肠炎病毒TZ-10-2016的全基因序列分析及间接ELISA方法的建立[D]. 王仙.扬州大学 2018
[2]致猪腹泻病毒快速检测方法研究及分子流行病学调查[D]. 汪怿旸.扬州大学 2018
[3]猪轮状病毒GD-01-2015的全基因序列分析及双夹心ELISA方法的建立[D]. 杨娟.扬州大学 2017
[4]抗猪轮状病毒单克隆抗体的制备及双抗体夹心ELISA检测方法的初步建立[D]. 孟柳.东北农业大学 2014
[5]猪轮状病毒VP7蛋白单克隆抗体制备与其抗原表位的初步鉴定[D]. 秦昭恒.东北农业大学 2014
[6]J亚群禽白血病病毒表面糖蛋白SU和兔IgGFc融合蛋白的表达及初步应用[D]. 孙薇薇.扬州大学 2013
[7]猪轮状病毒地方株的分离鉴定及其VP6基因的克隆与原核表达[D]. 陈淑红.东北农业大学 2003
[8]A群猪轮状病毒OSU株VP7基因的克隆及其在杆状病毒中的表达[D]. 徐宏军.东北农业大学 2002
本文编号：2928484
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