猪源产肠毒素大肠杆菌多重PCR检测方法的建立及整合子介导的耐药性分析

发布时间：2021-01-05 03:25

　　产肠毒素大肠杆菌（Enterotoxigenic E. coli,ETEC）是一种最常见的能够引起仔猪急性水样腹泻和迅速脱水死亡的致病性大肠埃希菌，导致仔猪很高的发病率和死亡率，这给养殖业带来了巨大的经济损失。近年来该菌耐药性不断上升并呈现较严重的多重耐药性，其耐药问题已成为影响人类健康和养殖业发展的重要因素。对产肠毒素大肠杆菌的准确诊断以及监控该菌的耐药状况，是有效预防和治疗产肠毒素大肠杆菌引发的仔猪腹泻的前提。本试验首先建立一个能同时检测ETEC不耐热肠毒（Heat-labile enterotoxin，LT），耐热肠毒素（Heat-stable enterotoxin，STa）和粘附素（fimbriae，F4）等三种毒力因子的多重PCR检测方法。然后对江西省南昌周边地区的猪源大肠杆菌120株分离株进行检测，共检出79株ETEC阳性菌株，即ETEC的检出率为65.8%（79/120），其主要毒力基因型是STa和F4的毒力表型。随机选取40株ETEC阳性菌株，采用K-B纸片法测定其对20种常用抗菌药物的敏感性。结果表明分离株对复方新诺明（SMZ）、四环素（TCY）、利福平（RIF）和... 

【文章来源】：江西农业大学江西省

【文章页数】：57 页

【学位级别】：硕士

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英文缩略词表
摘要
Abstract
第一部分 文献综述
    1 产肠毒素大肠杆菌性仔猪腹泻主要毒力因子研究进展
        1.1 粘附素
        1.2 肠毒素
        1.3 致病机理
        1.4 ETEC 的检测
    2 大肠杆菌的耐药机制
        2.1 天然性耐药
        2.2 获得性耐药
    3 大肠杆菌多重耐药性与整合子的研究
        3.1 大肠杆菌多重耐药耐药现状
        3.2 整合子-基因盒系统
        3.3 整合子介导的大肠埃希菌耐药
        3.4 整合子-基因盒系统的检测
        3.5 展望
第二部分 试验部分
    试验一 猪产肠毒素性大肠杆菌多重 PCR 检测方法的建立
        1 材料
            1.1 参考菌株
            1.2 病料来源
            1.3 主要培养基
            1.4 试剂
            1.5 仪器设备
        2 方法
            2.1 引物设计与合成
            2.2 模板的制备
            2.3 PCR 扩增
            2.4 PCR 产物的纯化
            2.5 目的片段的连接与转化
            2.6 重组质粒的鉴定
            2.7 STa、LT 和 F4 单项 PCR 条件的优化
            2.8 STa、LT 和 F4 多重 PCR 条件的优化
        3 结果
            3.1 单项 PCR 退火温度的确定
            3.2 单项 PCR 敏感性的确定
            3.3 单项 PCR 引物的特异性检测
            3.4 三重 PCR 退火温度的确定
            3.5 三重 PCR 扩增的灵敏性
            3.6 三重 PCR 扩增的特异性
            3.7 ETEC 标准菌 PCR 产物的测序结果
            3.8 临床分离菌株的检测
        4 小结与讨论
    试验二 江西产肠毒素大肠杆菌分离株的耐药性检测和分析
        1 材料
            1.1 菌株与培养基
            1.3 主要试剂
        2 方法
        3 结果与分析
            3.1 药敏试验结果
            3.2 产肠毒素大肠杆菌的耐药性分析
            3.3 产肠毒素大肠杆菌多重耐药分析
            3.4 交叉耐药分析
        4 小结与讨论
    试验三 整合子-基因盒系统的检测、定位与分析
        1 材料
            1.1 菌株与培养基
            1.2 主要仪器与设备
            1.3 试剂
        2 方法
            2.1 细菌总 DNA 模板的制备
            2.2 引物设计与合成
            2.3 PCR 扩增
            2.4 Ⅰ类整合子基因盒插入区 CS1 的测序
            2.5 Ⅰ型整合子-基因盒定位
        3 结果与分析
            3.1 产肠毒素大肠杆菌 Ⅰ 类和 Ⅱ 类整合酶基因的检测与分析
            3.2 qacE△ 1-sul1 基因的检测与分析
            3.3 整合子基因盒插入区 CS1 的分析
            3.4 菌株携带 Ⅰ 型整合子、耐药基因盒与耐药表型分析的关系
            3.5 Ⅰ 型整合子的定位
        4 分析与讨论
全文总结
参考文献
致谢



本文编号：2957930