猪链球菌2型主要毒力因子三重荧光定量PCR快速检测方法的建立和初步应用

发布时间：2021-01-06 05:34

　　猪链球菌是猪的常见病原体,猪链球菌病是多种链球菌引起猪的一类疾病的总称,其中由猪链球菌2型引起的疾病是一种重要的人畜共患病。该病原可使猪产生脑膜炎、关节炎、心内膜炎、肺炎、败血症等多种病症甚至可引起急性死亡,同时还可感染人并致人死亡。根据菌体表面荚膜多糖的差异,将其分为35个血清型（1-34型及1/2型）,其中以2型分布最普遍,致病力也最强,1型、7型以及9型则次之。本研究首先建立了一种对猪链球菌2型3个重要毒力因子CPS2J、MRP、EF同时检测的三重荧光定量PCR方法。针对临床采集标本容易污染、不易分离出典型菌落的现状,研究出了一种猪链球菌选择性增菌液,提高了其临床分离效率,缩短了检测时间。基于以上两部分研究,对上海奉贤地区临床表观健康猪群的猪链球菌携带情况进行了检测。依据GenBank上的CP2SJ、MRP、EF基因保守序列,用软件Primer Express 3.0设计各自对应的引物以及Taqman控针,其中CP2SJ、MRP、EF探针5’端分别标记FAM、HEX、CY5荧光发射基团,3’均以BHQ1荧光淬灭基团标记。通过对反应体系及扩增条件的优化,建立了一种Taqman探针法... 

【文章来源】：南京农业大学江苏省 211工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：69 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
中文摘要
ABSTRACT
符号及缩略语
第一篇 文献综述
    第一章 猪链球菌的研究概述
        1 猪链球菌简介
            1.1 猪链球菌的历史概况
            1.2 猪链球菌病原学
                1.2.1 分类
                1.2.2 形态及染色特性
                1.2.3 培养特性
                1.2.4 抗抗力
                1.2.5 耐药性
            1.3 猪链球菌流行病学研究
            1.4 猪链球菌毒力因子研究
                1.4.1 荚膜多糖（CPS）
                1.4.2 溶菌酶释放蛋白（MRP）和胞外蛋白因子（EF）
                1.4.3 溶血素（SLY）
                1.4.4 谷氨酸脱氢酶（GDH）
                1.4.5 甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）
                1.4.6 纤连蛋白和纤连蛋白原结合蛋白（FBPS）
                1.4.7 毒力相关序列（orf2）
                1.4.8 89k毒力岛
                1.4.9 其他毒力因子
            1.5 致病机制
            1.6 猪链球菌的检测方法及研究进展
                1.6.1 经典鉴定方法
                1.6.2 分子生物学方法
            1.7 本试验研究的目的与意义
第二篇 试验部分
    第二章 猪链球菌2型主要毒力因子三重荧光定量PCR检测方法的建立
        摘要
        1 试验材料
            1.1 主要试剂
            1.2 主要设备
            1.3 种系背景明确的试验对照菌株
            1.4 引物及探针
            1.5 相关主要试剂的制备
            1.6 猪链球菌2型细菌基因组DNA的提取
            1.7 三重实时荧光定量PCR阳性标准品的制备
                1.7.1 目的片段的PCR扩增及电泳成像
                1.7.2 PCR产物胶回收
                1.7.3 胶回收产物连接
                1.7.4 连接产物转化
                1.7.5 阳性克隆的PCR筛选及测序验证
                1.7.6 重组质粒阳性模板标准的制备
                1.7.7 重组质粒浓度的测定及计算
        2 三重荧光定量PCR检测方法的建立
            2.1 三重荧光定量PCR反应条件的优化
            2.2 三重荧光定量PCR扩增曲线及标准曲线的建立
            2.3 敏感性试验
            2.4 特异性试验
            2.5 重复性试验
        3 结果
            3.1 目的片段的PCR扩增
            3.2 重组质粒的制备和浓度测定
            3.3 Taqman法单项实时荧光定量PCR检测方法的建立
            3.4 Taqman法三重实时荧光定量PCR检测方法及标准曲线的建立
                3.4.1 反应体系和反应条件
                3.4.2 Taqman三重实时荧光定量PCR标准曲线
            3.5 敏感性试验
                3.5.1 普通PCR检测猪链球菌2型敏感性试验
                3.5.2 三重荧光定量PCR检测猪链球菌2型敏感性试验
            3.6 三重荧光定量PCR检测猪链球菌2型的特异性
            3.7 三重荧光定量PCR的重复性试验
        4 讨论
    第三章 猪链球菌选择性增菌液的研究
        摘要
        1 材料和方法
            1.1 菌株
                1.1.1 受试菌株
                1.1.2 其他菌株
            1.2 培养基
            1.3 抗生素药敏纸片
            1.4 抗生素添加剂
            1.5 麦氏比浊管
        2 方法
            2.1 抗菌药物敏感试验
            2.2 抗菌药物最小抑菌浓度（MIC）的测定
            2.3 抗菌药物对其他菌的抑制情况
            2.4 组合抗菌药物添加培养基的效果
            2.5 模拟污染样本分离猪链球菌情况的初步比较
        3 结果
            3.1 猪链球菌2型对部分抗菌药物的敏感性
            3.2 抗菌药物最小抑菌浓度（MIC）的测定
            3.3 抗菌药物对其他菌的抑制情况
            3.4 组合抗菌药物添加培养基的效果
            3.5 模拟污染样本分离猪链球菌情况的初步比较
        4 讨论
    第四章 上海部分地区临床表观健康猪群猪链球菌携带情况的检测
        摘要
        1 材料和方法
            1.1 参考菌株及培养条件
            1.2 所用试剂,仪器和设备
                1.2.1 试剂
                1.2.2 仪器设备
            1.3 引物合成
        2 样品处理
            2.1 样品的采集
            2.2 样品的均质、增菌和分离
            2.3 模板的制备
            2.4 常规方法初步鉴定
            2.5 猪链球菌菌株型鉴定
            2.6 猪链球菌2型毒力因子检测
        3 结果
            3.1 猪链球菌形态学观察
            3.2 猪链球菌革兰氏染色观察
            3.3 淋巴结样品中猪链球菌分布情况
            3.4 GDH阳性的猪链球菌2型毒力因子检测结果
        4 讨论
参考文献
全文总结
致谢


【参考文献】：
期刊论文
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硕士论文
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[3]上海地区致病性猪链球菌及其毒力基因的检测[D]. 李小军.南京农业大学 2007
[4]中国部分地区猪链球菌遗传背景及进化关系研究[D]. 蔡振鸿.南京农业大学 2007
[5]猪链球菌2型强毒株srtA基因缺失株的构建及其毒力分析[D]. 董亚青.南京农业大学 2007



本文编号：2960019