猪圆环病毒3型的分离与鉴定
发布时间：2021-01-07 18:48
为分离获得猪圆环病毒3型（PCV3）,对疑似PCV感染死亡的仔猪病料进行PCR检测,将检测呈PCV3阳性的样品利用PK-15细胞进行病毒分离,同时利用原核表达的Cap蛋白制备多克隆抗体,通过IFA、免疫电镜和序列测定分析对分离株进行鉴定。结果显示,分离获得1株PCV3流行毒株,IFA检测有特异性荧光;电镜下可见圆形、直径约为20 nm的病毒粒子;与PCV1、PCV2的同源性分别为22.2%、22.1%,属于3a亚型,将其命名为LJ0603株。LJ0603株繁殖至第72小时病毒含量最高,且能稳定传代至第13代。PCV3 LJ0603株的获得为其结构功能和致病机制及免疫预防等研究奠定了基础。
【文章来源】：中国兽医科学. 2020,50(10)北大核心
【文章页数】：7 页
【部分图文】：
PCV3Cap基因的扩增Figure1AmplificationofPCV3CapgenebyPCRM：DNA分子质量标准；1：心；2：肝；3：脾；4：肾；5：阴性对照
中国兽医科学第50卷图5PCV3LJ0603毒株的免疫电镜观察30000×Figure5ObservationofPCV3LJ0603byimmunoelectronmicroscopya：与病毒液作用后；b：与细胞液作用后。a：Afterinteractionwithvirussolution；b：Afterinteractionwithcellso-lution.ab图4免疫荧光检测结果Figure4Immunofluorescencetestresultsa：PCV3LJ0603感染的PK-15细胞（PCV3Cap蛋白多克隆抗体）；b：PK-15细胞对照（PCV3Cap蛋白多克隆抗体）；c：PCV3LJ0603感染的PK-15细胞（猪阳性血清）；d：PK-15细胞对照（猪阳性血清）。a：PK-15cellsinfectedwithPCV3LJ0603（PCV3Capproteinpolyclonalantibody）；b：Negativecontrol（PCV3Capproteinpolyclonalantibody）；c：PK-15cellsinfectedwithPCV3LJ0603（Porcinepositiveserum）；d：Negativecontrol（Porcinepositiveserum）.图3重组Cap蛋白表达和纯化产物的SDS-PAGE与Western-blot鉴定Figure3SDS-PAGEandWestern-blotidentificationofrecombinantCapproteinexpressionandpurificationM：蛋白质分子质量标准；1：诱导后菌体；2：诱导前菌体；3：诱导后空载体对照；4：纯化后Cap蛋白。M：ProteinmolecularweightMarker；1：Bacteriaafterinduction；2：Bacteriabeforeinduction；3：Emptyvectorcontrolafterinduction；4：Purifiedprotein.图2重组质粒pET-32a-Cap的酶切鉴定Figure2EnzymedigestionidentificationofrecombinantplasmidpET-32a-CapM：DNA分子质量标准；1：pET-32a-Cap的双酶切产物；2：pET-32a-Cap的单酶切产物。M：DL8000DNAMarker；1：DoubleenzymedigestionfrompET-32a-Cap；2：SingleenzymedigestionproductfrompET-32a-Cap.
dwithPCV3LJ0603（Porcinepositiveserum）；d：Negativecontrol（Porcinepositiveserum）.图3重组Cap蛋白表达和纯化产物的SDS-PAGE与Western-blot鉴定Figure3SDS-PAGEandWestern-blotidentificationofrecombinantCapproteinexpressionandpurificationM：蛋白质分子质量标准；1：诱导后菌体；2：诱导前菌体；3：诱导后空载体对照；4：纯化后Cap蛋白。M：ProteinmolecularweightMarker；1：Bacteriaafterinduction；2：Bacteriabeforeinduction；3：Emptyvectorcontrolafterinduction；4：Purifiedprotein.图2重组质粒pET-32a-Cap的酶切鉴定Figure2EnzymedigestionidentificationofrecombinantplasmidpET-32a-CapM：DNA分子质量标准；1：pET-32a-Cap的双酶切产物；2：pET-32a-Cap的单酶切产物。M：DL8000DNAMarker；1：DoubleenzymedigestionfrompET-32a-Cap；2：SingleenzymedigestionproductfrompET-32a-Cap.对纯化蛋白进行Western-blot鉴定，结果显示纯化的Cap蛋白可以与His标签抗体（见图3c）和PCV3猪阳性血清（见图3d）反应，表明目的条带大小正确，具有较好的特异性。2.4PCV3的分离鉴定处理阳性样品并接种于PK-15细胞传代，对第8代接毒细胞使用IFA进行检测。结果显示，小鼠抗Cap多克隆抗体与PCV3猪阳性血清均可以与接毒细胞发生特异性反应，产生绿色荧光，PK-15细胞对照组无荧光（见图4）。细胞病毒液与小鼠抗Cap多克隆抗体作用后，经电镜观察发现有形态均一的病毒颗粒（见图5），单个病毒粒子直径约为20nm，与PCV3大小一致［10］，阴性对照未观察到病毒粒子。将该毒株命名
【参考文献】：
期刊论文
[1]2011—2017年华东地区猪圆环病毒3型分子流行病学调查[J]. 李勇,姜辰龙,刘刚,姜平,白娟. 中国兽医科学. 2018(08)
[2]猪圆环病毒3型研究进展[J]. 张永宁,梅琳,张舟,唐丽杰,吴绍强. 东北农业大学学报. 2017(09)
硕士论文
[1]7种猪病毒性疫病QIAxcel及Bio-Plex检测方法的建立与初步应用[D]. 肖璐.四川农业大学 2017
[2]猪流行性腹泻病毒NJ株的分离与鉴定[D]. 施雯.东北农业大学 2014
本文编号：2963057
【文章来源】：中国兽医科学. 2020,50(10)北大核心
【文章页数】：7 页
【部分图文】：
PCV3Cap基因的扩增Figure1AmplificationofPCV3CapgenebyPCRM：DNA分子质量标准；1：心；2：肝；3：脾；4：肾；5：阴性对照
中国兽医科学第50卷图5PCV3LJ0603毒株的免疫电镜观察30000×Figure5ObservationofPCV3LJ0603byimmunoelectronmicroscopya：与病毒液作用后；b：与细胞液作用后。a：Afterinteractionwithvirussolution；b：Afterinteractionwithcellso-lution.ab图4免疫荧光检测结果Figure4Immunofluorescencetestresultsa：PCV3LJ0603感染的PK-15细胞（PCV3Cap蛋白多克隆抗体）；b：PK-15细胞对照（PCV3Cap蛋白多克隆抗体）；c：PCV3LJ0603感染的PK-15细胞（猪阳性血清）；d：PK-15细胞对照（猪阳性血清）。a：PK-15cellsinfectedwithPCV3LJ0603（PCV3Capproteinpolyclonalantibody）；b：Negativecontrol（PCV3Capproteinpolyclonalantibody）；c：PK-15cellsinfectedwithPCV3LJ0603（Porcinepositiveserum）；d：Negativecontrol（Porcinepositiveserum）.图3重组Cap蛋白表达和纯化产物的SDS-PAGE与Western-blot鉴定Figure3SDS-PAGEandWestern-blotidentificationofrecombinantCapproteinexpressionandpurificationM：蛋白质分子质量标准；1：诱导后菌体；2：诱导前菌体；3：诱导后空载体对照；4：纯化后Cap蛋白。M：ProteinmolecularweightMarker；1：Bacteriaafterinduction；2：Bacteriabeforeinduction；3：Emptyvectorcontrolafterinduction；4：Purifiedprotein.图2重组质粒pET-32a-Cap的酶切鉴定Figure2EnzymedigestionidentificationofrecombinantplasmidpET-32a-CapM：DNA分子质量标准；1：pET-32a-Cap的双酶切产物；2：pET-32a-Cap的单酶切产物。M：DL8000DNAMarker；1：DoubleenzymedigestionfrompET-32a-Cap；2：SingleenzymedigestionproductfrompET-32a-Cap.
dwithPCV3LJ0603（Porcinepositiveserum）；d：Negativecontrol（Porcinepositiveserum）.图3重组Cap蛋白表达和纯化产物的SDS-PAGE与Western-blot鉴定Figure3SDS-PAGEandWestern-blotidentificationofrecombinantCapproteinexpressionandpurificationM：蛋白质分子质量标准；1：诱导后菌体；2：诱导前菌体；3：诱导后空载体对照；4：纯化后Cap蛋白。M：ProteinmolecularweightMarker；1：Bacteriaafterinduction；2：Bacteriabeforeinduction；3：Emptyvectorcontrolafterinduction；4：Purifiedprotein.图2重组质粒pET-32a-Cap的酶切鉴定Figure2EnzymedigestionidentificationofrecombinantplasmidpET-32a-CapM：DNA分子质量标准；1：pET-32a-Cap的双酶切产物；2：pET-32a-Cap的单酶切产物。M：DL8000DNAMarker；1：DoubleenzymedigestionfrompET-32a-Cap；2：SingleenzymedigestionproductfrompET-32a-Cap.对纯化蛋白进行Western-blot鉴定，结果显示纯化的Cap蛋白可以与His标签抗体（见图3c）和PCV3猪阳性血清（见图3d）反应，表明目的条带大小正确，具有较好的特异性。2.4PCV3的分离鉴定处理阳性样品并接种于PK-15细胞传代，对第8代接毒细胞使用IFA进行检测。结果显示，小鼠抗Cap多克隆抗体与PCV3猪阳性血清均可以与接毒细胞发生特异性反应，产生绿色荧光，PK-15细胞对照组无荧光（见图4）。细胞病毒液与小鼠抗Cap多克隆抗体作用后，经电镜观察发现有形态均一的病毒颗粒（见图5），单个病毒粒子直径约为20nm，与PCV3大小一致［10］，阴性对照未观察到病毒粒子。将该毒株命名
【参考文献】：
期刊论文
[1]2011—2017年华东地区猪圆环病毒3型分子流行病学调查[J]. 李勇,姜辰龙,刘刚,姜平,白娟. 中国兽医科学. 2018(08)
[2]猪圆环病毒3型研究进展[J]. 张永宁,梅琳,张舟,唐丽杰,吴绍强. 东北农业大学学报. 2017(09)
硕士论文
[1]7种猪病毒性疫病QIAxcel及Bio-Plex检测方法的建立与初步应用[D]. 肖璐.四川农业大学 2017
[2]猪流行性腹泻病毒NJ株的分离与鉴定[D]. 施雯.东北农业大学 2014
本文编号：2963057
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