猪肺炎支原体部分血清体液免疫显性蛋白抗原的筛选鉴定

发布时间：2021-01-10 20:05

　　猪支原体肺炎（Mycoplasmal pneumonia of swine,MPS）是由猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp）感染引起的猪的一种慢性呼吸道传染病。灭活疫苗接种是目前控制该病最主要的策略,但这种疫苗免疫保护效果有限,也不能阻断病原在呼吸道的定殖及病原在猪群内和猪群之间的传播。因此,迫切需要开发新一代更加有效的疫苗。疫苗制备的核心之一是筛选具有良好免疫保护效果的抗原。本实验室已经建立了猪肺炎支原体血清体液免疫显性蛋白抗原的筛选方法和区分高免血清与恢复期血清体液免疫显性蛋白抗原的方法,能大规模筛选血清体液免疫显性蛋白抗原。因此,本研究在优化前期已经建立的区分高免血清与恢复期血清的血清体液免疫显性蛋白抗原方法的基础上,筛选血清体液免疫显性蛋白和区分高免血清与恢复期血清的血清体液免疫显性蛋白抗原,为猪肺炎支原体保护性抗原的筛选提供候选蛋白抗原。1.区分猪肺炎支原体高免血清与恢复期血清的血清体液免疫显性蛋白抗原ELISA方法的优化目的:优化本实验室前期建立的区分猪肺炎支原体高免血清与恢复期血清的血清体液免疫显性蛋白抗原ELISA方法。方法:将GST... 

【文章来源】：西南大学重庆市 211工程院校 教育部直属院校

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SDS-PAGE检测GST-Mhp366重组蛋白、GST蛋白的表达

第三章区分猪肺炎支原体高免血清和恢复期血清的血清体液免疫显性蛋白抗原ELISA方法的优化29图3-2最佳血清稀释度和最佳酶标二抗工作浓度的确定Fig.3-2DeterminationofoptimaldilutionofserumandHRP-conjugatedrabbitanti-pigIgG3.4讨论本实验室已建立了一种快速鉴定猪肺炎支原体血清体液免疫显性蛋白抗原ELISA方法[72]，能够快速筛选出血清体液免疫显性蛋白抗原。鉴定出的血清体液免疫显性蛋白可进一步用于寻找区分性血清体液免疫显性蛋白。但在建立该方法时，直接采用了快速鉴定猪肺炎支原体免疫显性蛋白抗原ELISA方法中的最佳抗原包被浓度和最佳封闭液选择的条件[73]，在此方法中未对这两个条件进行再次探索，由此建立的方法不够精确、严谨。在本章节中，对最佳抗原包被浓度、最佳封闭液的选择条件进行摸索，对最佳血清稀释度与最佳酶标二抗工作浓度的条件再次确定，由此确定了区分性血清体液免疫显性蛋白抗原ELISA方法中的最佳参数，优化了区分性血清体液免疫显性蛋白抗原ELISA方法。Meens等人研究表明猪恢复期血清对Mhp366蛋白具有很强的免疫反应，而不能识别高免血清[71]。此外，用Mhp366蛋白多克隆抗体，不能在体外培养的Mhp菌株中检测到Mhp366。因此，可以基于Mhp366蛋白区分高免血清与恢复期血清。猪血清中可能含有与其他细菌蛋白的抗体，为了尽量避免这些抗体的干扰，所有血清样品均用GST工程菌裂解液进行了预吸附。同时，为了得到更可靠的Mhp366蛋白与血清反应的相对OD450值，我们用GST-Mhp366重组菌裂解物与血清反应得到的OD450减去GST工程菌细菌裂解物与血清反应得到的OD450。通常很难在ELISA标准化中确定临界值，因为必须将OD的连续变化转换为定性反应（阳性或阴性）[74]。先前已将许多标准应用于ELISA的临

第四章部分猪肺炎支原体蛋白的原核可溶表达41（3）每管加入20μLPBS和3μLPreScissionProtease，室温旋转（25r/min）酶切5h或旋转酶切过夜，4℃10000r/min离心1min，取12μL上清，加入3μL5×SDS-PAGE上样缓冲液，105℃处理10min，瞬时离心。（4）12%SDS-PAGE电泳，检测重组蛋白的酶切情况。4.3结果4.3.1基因片段的PCR扩增结果以pGEX-6P-1-mhp246质粒为模板，PCR扩增出大小分别为759bp、702bp的mhp246-N、mhp246-C片段；以pGEX-6P-1-mhp353质粒为模板，PCR扩增出大小为873bp的mhp353-C片段。所有目的片段大小均与预计大小相符。图4-1PCR扩增mhp246-N、mhp246-C、mhp353-C片段Fig.4-1Amplificationofmhp246-N,mhp246-Candmhp353-CfregmentsbyPCR4.3.233个重组质粒的酶切鉴定提取33个重组菌中的重组质粒，经双酶切后，得到与预期大小相同的目的基因片段4984bp、4974bp、4968bp的载体片段和与预期大小相符的基因片段（图4-2A），片段大小分别为822bp（mhp024）、720bp（mhp067-1）、828bp（mhp067-2）、1044bp（mhp067-3）、1440bp（mhp067-4）、681bp（mhp067-5）、1044bp（mhp144）、1053bp（mhp170）、759bp（mhp246-N）、702bp（mhp246-C）、828bp（mhp263）、1356bp（mhp274）、1383bp（mhp275）、543bp（mhp303）、894bp（mhp320）、894bp（mhp326）、648bp（mhp347）、873bp（mhp353-C）、669bp（mhp354）、1404bp（mhp435）、930bp（mhp440）、1773bp（mhp444）、1395bp（mhp460）、1542bp（mhp482）、1824bp（mhp520）、552bp（mhp565-1）、1101bp（mhp565-2）、549bp（mhp565-3）、1047bp（mhp565-4）、837bp（mhp565-5）、

【参考文献】：
期刊论文
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本文编号：2969327