猪流行性腹泻病毒S蛋白特异性单域抗体的制备及鉴定
发布时间：2021-01-10 21:15
猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus PEDV）是引起猪的急性、接触性肠道传染病的主要病原体,PEDV可在猪群中持续存在,主要症状为呕吐、腹泻和脱水,各种年龄和品种的猪都易感。感染发病后引起的仔猪病死率偏高,给养猪业造成了巨大的经济损失。目前我国主要采用疫苗免疫的方法防控猪流行性腹泻（PED）,但是疫苗免疫存在免疫空白期,仔猪的免疫功能不完善,易发生PED,用基因工程制备的单域抗体可以弥补这个缺陷。PEDV纤突蛋白（Spike protein S蛋白）位于病毒表面,包含病毒的多个中和表位和受体结合域,与病毒的抗原性和吸附入侵密切相关。S蛋白是目前新型基因工程疫苗和被动免疫制剂研发的主要靶点。单域抗体具有高水溶性、低免疫原性、高抗原结合活性和高稳定性等特点,作为被动免疫,效应快,不需经过潜伏期,一经输入,可立即获得免疫力,能够有效防控疾病。本试验中使用S蛋白作为筛选抗原从已构建好的噬菌体抗体库进行筛选,选取了Phage ELISA鉴定结果中对PEDV相对结合能力较强的一株阳性克隆,通过质粒重组,将单域抗体基因片段与表达载体pET-28a连接,并...
【文章来源】：内蒙古农业大学内蒙古自治区
【文章页数】：44 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
7抗体氨基酸序列及抗体功能区分析结果
图 1 重组噬菌体对 PEDV S 蛋白的免疫活性的 ELISA 检测Fig.1 ELISAassay of the immunoreactivity of recombinant phage on S protein of PEDVDV S 蛋白特异性单域抗体 VHH 序列分析的 20 个阳性克隆经过基因序列测定和分析后，将序列相同的克隆分为 种不同的序列，其中 9、33、35、50、65、67 号克隆是相同的序列，78、81 是相同的序列， 41、75 是相同的序列，剩余的 6 个克隆有 6通过与网上已公开和发表的骆驼 VHH 抗体基因序列比对后，发现有单域抗体 VHH 基因片段，我们选取结合活性较高的 7 号克隆进行了能鉴定，S7 抗体氨基酸序列分析结果如图 2。
图 3 S7 克隆质粒酶切和 pET-28a 质粒酶切结果Fig3 S7 plasmidand pET-28a plasmid was digested by Nco I and NotlaneM：DL5000 Marker，Lane1S7 克隆质粒，Lane2 pET-28a 质粒28a 重组菌落 PCR 鉴定结果T-28a 重组菌落为模板，进行 PCR 扩增鉴定，经 1 400 bp 左右的条带，与预期的片段大小相符。结果
【参考文献】：
期刊论文
[1]猪流行性腹泻病毒流行毒株的分离与鉴定[J]. 周书亭,谢洋洋,丁思嘉,郑煜名,蔡雨豪,罗依然,袁聪俐,杨志彪. 中国兽医科学. 2017(08)
[2]一起猪流行性腹泻病原S基因的序列分析[J]. 马良,李晓冉,邵葳. 黑龙江畜牧兽医. 2017(05)
[3]骆驼来源单域抗体的研究进展[J]. 于吉军,杨光,周婷婷,冯健男. 国际药学研究杂志. 2017(01)
[4]噬菌体展示技术的研究与应用[J]. 牛登云,刘昊,张蕾,孙彦刚,闫喜军. 黑龙江畜牧兽医. 2016(03)
[5]番木瓜蛋氨酸亚砜还原酶B1（PaMsrB1）的真核表达及其活性检测[J]. 张列,庹德财,沈文涛,周鹏. 分子植物育种. 2015(05)
[6]噬菌体抗体库构建和筛选技术及应用研究进展[J]. 王志文,陈昌杰. 蚌埠医学院学报. 2015(01)
[7]纳米抗体的应用及其研究新进展[J]. 姜忍忍,许超,周小理,姚刚. 生命的化学. 2013(03)
[8]猪流行性腹泻的诊断技术及预防策略[J]. 照日格图,王振普,李志国. 中国猪业. 2013(S2)
[9]纳米抗体的特性及其应用研究进展[J]. 郭婷,张宇昊,马良. 食品科学. 2013(03)
[10]单域重链抗体的分子特征[J]. 潘欣,蔡家麟,王颖. 生物技术通讯. 2012(05)
硕士论文
[1]PEDV检测纳米PCR方法的建立及其分子流行病学调查[D]. 朱禹.黑龙江八一农垦大学 2017
[2]猪流行性腹泻病毒S蛋白的表达及其特异性单域抗体的制备[D]. 赵鑫鑫.内蒙古农业大学 2017
[3]猪流行性腹泻病毒S蛋白的单抗制备及夹心ELISA检测PEDV方法建立与应用[D]. 王明月.吉林大学 2016
[4]MSTN纳米抗体的筛选和功能验证[D]. 李尤简.石河子大学 2015
[5]新生仔猪流行性腹泻病理学观察及发病相关因素调查[D]. 任庆海.山东农业大学 2013
[6]犬细小病毒单域抗体库筛选及单域抗体表达研究[D]. 詹俊杰.山西农业大学 2013
本文编号：2969426
【文章来源】：内蒙古农业大学内蒙古自治区
【文章页数】：44 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
7抗体氨基酸序列及抗体功能区分析结果
图 1 重组噬菌体对 PEDV S 蛋白的免疫活性的 ELISA 检测Fig.1 ELISAassay of the immunoreactivity of recombinant phage on S protein of PEDVDV S 蛋白特异性单域抗体 VHH 序列分析的 20 个阳性克隆经过基因序列测定和分析后，将序列相同的克隆分为 种不同的序列，其中 9、33、35、50、65、67 号克隆是相同的序列，78、81 是相同的序列， 41、75 是相同的序列，剩余的 6 个克隆有 6通过与网上已公开和发表的骆驼 VHH 抗体基因序列比对后，发现有单域抗体 VHH 基因片段，我们选取结合活性较高的 7 号克隆进行了能鉴定，S7 抗体氨基酸序列分析结果如图 2。
图 3 S7 克隆质粒酶切和 pET-28a 质粒酶切结果Fig3 S7 plasmidand pET-28a plasmid was digested by Nco I and NotlaneM：DL5000 Marker，Lane1S7 克隆质粒，Lane2 pET-28a 质粒28a 重组菌落 PCR 鉴定结果T-28a 重组菌落为模板，进行 PCR 扩增鉴定，经 1 400 bp 左右的条带，与预期的片段大小相符。结果
【参考文献】：
期刊论文
[1]猪流行性腹泻病毒流行毒株的分离与鉴定[J]. 周书亭,谢洋洋,丁思嘉,郑煜名,蔡雨豪,罗依然,袁聪俐,杨志彪. 中国兽医科学. 2017(08)
[2]一起猪流行性腹泻病原S基因的序列分析[J]. 马良,李晓冉,邵葳. 黑龙江畜牧兽医. 2017(05)
[3]骆驼来源单域抗体的研究进展[J]. 于吉军,杨光,周婷婷,冯健男. 国际药学研究杂志. 2017(01)
[4]噬菌体展示技术的研究与应用[J]. 牛登云,刘昊,张蕾,孙彦刚,闫喜军. 黑龙江畜牧兽医. 2016(03)
[5]番木瓜蛋氨酸亚砜还原酶B1（PaMsrB1）的真核表达及其活性检测[J]. 张列,庹德财,沈文涛,周鹏. 分子植物育种. 2015(05)
[6]噬菌体抗体库构建和筛选技术及应用研究进展[J]. 王志文,陈昌杰. 蚌埠医学院学报. 2015(01)
[7]纳米抗体的应用及其研究新进展[J]. 姜忍忍,许超,周小理,姚刚. 生命的化学. 2013(03)
[8]猪流行性腹泻的诊断技术及预防策略[J]. 照日格图,王振普,李志国. 中国猪业. 2013(S2)
[9]纳米抗体的特性及其应用研究进展[J]. 郭婷,张宇昊,马良. 食品科学. 2013(03)
[10]单域重链抗体的分子特征[J]. 潘欣,蔡家麟,王颖. 生物技术通讯. 2012(05)
硕士论文
[1]PEDV检测纳米PCR方法的建立及其分子流行病学调查[D]. 朱禹.黑龙江八一农垦大学 2017
[2]猪流行性腹泻病毒S蛋白的表达及其特异性单域抗体的制备[D]. 赵鑫鑫.内蒙古农业大学 2017
[3]猪流行性腹泻病毒S蛋白的单抗制备及夹心ELISA检测PEDV方法建立与应用[D]. 王明月.吉林大学 2016
[4]MSTN纳米抗体的筛选和功能验证[D]. 李尤简.石河子大学 2015
[5]新生仔猪流行性腹泻病理学观察及发病相关因素调查[D]. 任庆海.山东农业大学 2013
[6]犬细小病毒单域抗体库筛选及单域抗体表达研究[D]. 詹俊杰.山西农业大学 2013
本文编号：2969426
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