弓形虫B1等基因Real-time PCR与截短SAG2基因克

发布时间：2021-01-11 08:19

　　选取弓形虫基因组中高度保守的多拷贝基因529bp重复序列、ITS-1序列和B1基因作real-time PC R检测靶基因,建立检测弓形虫的三重SYBRGreen I实时荧光定量PCR的检测方法并且与ELISA检测方法进行比较。将529bp重复序列、B1基因、ITS-1序列的选定扩增序列进行克隆、测序构建标准品；将构建3个标准品放在一个体系中进行扩增,进行三重SYBRGreenI实时荧光定量PCR。529bp、ITS-1和B1的标准曲线的相关系数（R2）均为0.998,并且扩增效率均为96.724%,扩增片段的Tm值分别为86.5±0.5℃、78.8±0.5℃、83.1±0.5℃。构建的三重SYBRGreen Ⅰ实时荧光定量PCR特异性试验表明,529bp、ITS-1和B1有特异性的溶解曲线峰值分别是86.2℃、78.9℃和83.3℃,阴性对照无扩增曲线。敏感性试验表明,529bp、ITS-1和B1序列最低检出限分别为173copies/μL、 123copies/μL、和135copies/μL; Tm值的批内、批间重复试验的变异系数均小于0.3%. ELISA检测猪弓形虫IgG抗体... 

【文章来源】：福建农林大学福建省

【文章页数】：86 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

图１３标准品的洛解曲线??Ｆｉｇ．?１３?Ｍｅｌｔ?ｃｕｒｖｅ?ｏｆ?ｓｔａｎｄａｒｄ?ｐｒｏｄｕ幻Ｓ??２．４．３?ＳＹＢＲ?Ｇｒｅｅｎ?Ｉ巧光定量ＰＧＲ重复性??

??（３）从图１３中可Ｗ看出，ＳＹＢ民Ｇｒｅｅｎ?Ｉ?ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ?ＰＣ民的溶解曲线具有较强的??特异性，无非特异性扩增，ＰＵＭ－Ｔ－５２９ｂｐ、ＰＵＭ－Ｔ－ＩＴＳ－１和ＰＵＭ－Ｔ－Ｂ１标准品扩??增片段的Ｔｍ值分别为８６．５±０．５°Ｃ，?７８．８±０．５°Ｃ和８３．１±０．５‘Ｃ并作为；重ＳＹＢ民??Ｇｒｅｅｎ?Ｉ?ｒｅａｌｔｉｍｅ?ＰＣ民溶解曲线Ｔｍ值的阳性对照Ｔｍ值，见图１３。??Ｍｅ化?Ｃｕｒｖｅ??＂．９?＾＾￣??：：７８＇４獻品??言＇（ＩＴＳ－。?１１?＼??吉。．Ｖ?；?！‘！?８６．５?：；??７〇ｎｊ?７５！＜５?８０￣￣８５．０?９０．０?９５．５??｝?ｎｉ；Ｋ６．５？?Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ（＊Ｃ?）??图１３标准品的洛解曲线??Ｆｉｇ．?１３?Ｍｅｌｔ?ｃｕｒｖｅ?ｏｆ?ｓｔａｎｄａｒｄ?ｐｒｏｄｕ幻Ｓ??２．４．３?ＳＹＢＲ?Ｇｒｅｅｎ?Ｉ巧光定量ＰＧＲ重复性??选取不同拷贝数的标准品为样本，每个样本做Ｈ个重复，每次之间误差不到??１个循环，可见ＳＹＢＲ?Ｇｒｅｅｎ?Ｉ英光定量ＰＣＲ较高重复性，见表７。??表７?ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ?Ｉ巧光定量ＰＣＲ批内、批间重复性试验（ｎ＝３）??Ｔａｂ．?７?Ｉｎｔｒａ?ａｎｄ?ｉｎｔｅｒ－ａｓｓ巧?ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｉｌｉｔｙ?化巧?ｏＨｈｅ?ＳＹＢＲＧ化ｅｎ?Ｉ?ｒｅａｌ?ｔｉｍｅ?ＰＣ民（ｎ＝３）??重组质粒的浓度?批内变异试验?批内变异试验??基

【参考文献】：
期刊论文
[1]弓形虫强毒株和弱毒株致密颗粒蛋白1基因的比较研究[J]. 王红,李飞,曾瑾,李翠英,贾雪梅.  中国病原生物学杂志. 2011(08)
[2]弓形虫GRA1基因的克隆与原核表达[J]. 孙玲,刘慧颖,李淑红,宫鹏涛,张西臣,宁静.  吉林大学学报(医学版). 2011(04)
[3]刚地弓形虫表面抗原的功能和应用[J]. 徐安健,谷俊朝.  中国热带医学. 2011(03)
[4]纤维素滤膜过滤法纯化弓形虫速殖子并制备可溶性抗原[J]. 方正明,王升,苏斌涛,宫念樵,刘文琪,明长生.  中国寄生虫学与寄生虫病杂志. 2010(05)
[5]弓形虫膜表面抗原SAG2蛋白的高效表达及免疫活性分析[J]. 聂福旭,蒋蔚,王权,陈永军,胡永浩.  生物技术通报. 2010(04)
[6]PCR-SSCP技术在基因多态分析中的应用[J]. 汤贤春,路健,李学英.  中国西部科技. 2010(06)
[7]弓形虫致病机理、毒力及基因型研究进展[J]. 奚琳琳,李威.  中国病原生物学杂志. 2009(11)
[8]弓形虫表面抗原SAG1截短型片段在大肠杆菌中的可溶性表达及纯化[J]. 安立刚,蒋蔚,王权,陈永军,龚国华,周锦萍,邢小勇,孙泉云,丁铲.  生物技术通报. 2009(10)
[9]表达弓形虫棒状体蛋白1的重组乳酸乳球菌诱导小鼠免疫应答的研究[J]. 杨秋林,许丽芳,陆惠民.  中国血吸虫病防治杂志. 2009(02)
[10]PCR技术应用于寄生虫分类鉴定的研究进展[J]. 李晓娟,杨毅梅.  中国病原生物学杂志. 2009(01)



本文编号：2970422