鸡肠炎沙门氏菌SM6△cpxR/lon/hilA和SM6△cpxR/lon/hilA/cpdB基因缺失株的构建及其保护效

发布时间：2021-01-12 19:42

　　肠炎沙门氏菌（Salmonella enterica,SE）是一种兼性细胞内病原菌,能够引起多种动物发病。疫苗免疫是阻止SE进入食物链的一种有效方式,相对于灭活疫苗而言,弱毒疫苗对预防SE的肠道定植和全身性感染具有更好的效果。因此,研究一种安全、有效的疫苗是控制SE传播的首要任务。SE存在许多毒力相关基因,这些毒力相关基因的连锁作用,能够保证SE在营养缺乏的特殊宿主环境中生存并避免被宿主免疫系统清除。SE入侵宿主细胞是沙门氏菌感染的一个重要阶段,其入侵宿主细胞的过程需要侵袭基因的表达,hil A基因是对侵袭基因表达控制的一个主导者。环腺苷酸磷酸二酯酶（cpd B）基因可以水解细胞内第二信使（c AMP,环磷酸腺苷或c GMP,环磷酸鸟苷）,从而终结这些第二信使所传导的对细胞活动有重要调节功能的生化作用。为了进一步致弱SE的毒力,本研究通过Red重组的方法,在本实验室已构建双基因缺失菌株SM6△cpx R/lon基础上,通过缺失hil A基因和cpd B基因构建了无抗性标记的三基因缺菌株SM6△cpx R/lon/hil A和四基因缺失菌株SM6△cpx R/lon/hil A/cpd ... 

【文章来源】：东北农业大学黑龙江省 211工程院校

【文章页数】：98 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
摘要
英文摘要
1 引言
    1.1 沙门氏菌的研究概况
        1.1.1 沙门氏菌的病原学特征
        1.1.2 沙门氏菌的致病机制
        1.1.3 沙门氏菌主要毒力因子的研究进展
        1.1.4 细菌细胞内的第二信使及其信号传导
    1.2 Red重组系统
        1.2.1 Red重组系统的组成与作用机理
        1.2.2 Red重组的相关质粒与Red重组的应用
    1.3 沙门氏菌基因突变体疫苗
        1.3.1 沙门氏菌基因突变体疫苗研究背景
        1.3.2 沙门氏菌基因突变体疫苗的研究概况
    1.4 研究目的与意义
2 材料与方法
    2.1 试验材料
        2.1.1 质粒与菌株
        2.1.2 试验动物
        2.1.3 主要试剂
        2.1.4 主要仪器设备
    2.2 试验方法
        2.2.1 基因缺失株SM6△cpx R/lon/hil A的构建
        2.2.2 基因缺失株SM6△cpx R/lon/hil A/cpd B的构建
        2.2.3 基因缺失株SM6△cpx R/lon/hil A和SM6△cpx R/lon/hil A/cpd B的生长和生化特性
        2.2.4 基因缺失株作为候选疫苗的可行性研究
3 结果
    3.1 SM6△cpx R/lon/hil A基因缺失株的构建
        3.1.1 同源重组打靶PCR片段的获得
        3.1.2 hil A基因的敲除及PCR鉴定
    3.2 SM6△cpx R/lon/hil A/cpd B基因缺失株的构建
        3.2.1 同源重组打靶PCR片段的获得
        3.2.2 cpd B基因的敲除及PCR鉴定
    3.3 基因缺失株SM6△cpx R/lon/hil A和SM6△cpx R/lon/hil A/cpd B的生物学特性
        3.3.1 生长特性
        3.3.2 生化特性
        3.3.3 基因缺失株的遗传稳定性
        3.3.4 SM6△cpx R/lon/hil A, SM6△cpx R/lon/hil A/cpd B和SM6侵入率的差异
        3.3.5 细菌形态的变化
    3.4 基因缺失株作为候选疫苗的可行性研究
        3.4.1 三基因缺失株SM6△cpx R/lon/hil A的致病力测定
        3.4.2 四基因缺失株SM6△cpx R/lon/hil A/cpd B的致病力测定
        3.4.3 细菌在体内定植清除情况及对组织病理损伤的检测
        3.4.4 免疫途径的确定
        3.4.5 免疫剂量的确定
        3.4.6 SPF鸡免疫后血清特异性抗体的动态变化
        3.4.7 SPF鸡免疫后鸡脾脏CD4+、CD8+T细胞亚群百分比的动态变化
        3.4.8 SPF鸡免疫后外周血细胞因子的动态变化
        3.4.9 SPF鸡攻菌后的保护情况
        3.4.10 SPF鸡攻菌后荷菌数的变化及各脏器组织学病变
        3.4.11 SM6△cpx R/lon/hil A和SM6△cpx R/lon/hil A/cpd B免疫鸡只的抗体持续期试验
4 讨论
    4.1 基因缺失株的构建、生长、生化特性和安全性评价
    4.2 沙门氏菌基因缺失株疫苗SM6△cpx R/lon/hil A和SM6△cpx R/lon/hil A/cpd B的免疫效果评价
        4.2.1 沙门氏菌三基因缺失株SM6△cpx R/lon/hil A和 四基因缺失株SM6△cpx R/lon/hil A/cpd B免疫后对鸡的保护效果
        4.2.2 沙门氏菌三基因缺失疫苗株SM6△cpx R/lon/hil A和 四基因缺失疫苗株SM6△cpx R/lon/hil A/cpd B对体液免疫和细胞免疫的影响
5 结论
致谢
参考文献
攻读博士学位期间发表的学术论文


【参考文献】：
期刊论文
[1]肠炎沙门氏菌感染与宿主的关系[J]. 黎敏英,邓树轩.  畜牧与饲料科学. 2009(06)
[2]Red重组系统用于大肠杆菌基因修饰研究进展[J]. 张雪,温廷益.  中国生物工程杂志. 2008(12)
[3]减毒沙门菌疫苗研究进展[J]. 徐引弟,郭爱珍,陈焕春.  动物医学进展. 2008(08)
[4]沙门氏菌毒力岛及其Ⅲ型分泌系统[J]. 郭伟军,崔照琼,李华春.  上海畜牧兽医通讯. 2006(05)
[5]Red同源重组技术研究进展[J]. 韩聪,张惟材,游松.  中国生物工程杂志. 2003(12)
[6]Changes of CD8+CD28-T regulatory cells in rat model of colitis induced by 2,4-dinitrofluorobenzene[J]. Wen-Bin Xiao, Department of Gastroenterology, Peking University People’s Hospital, Beijing 100044, China Yu-Lan Liu, Department of Gastroenterology, Peking University People’s Hospital, Beijing 100044, China.  World Journal of Gastroenterology. 2003(11)
[7]减毒沙门氏菌活疫苗研究现状及其在家禽业的应用[J]. 张欣.  中国家禽. 2001(20)
[8]肠炎沙门氏菌引起食物中毒的细菌学调查[J]. 王章云,滕焕昭,李柏桂,林青成,褚保林.  中国人兽共患病杂志. 1999(03)



本文编号：2973427