利用鼠源因子诱导绵羊体细胞为多能性干细胞

发布时间：2021-01-15 03:15

　　由于诱导多能性干细胞在再生医学领域中重要的潜在应用价值,其进而成为近年的科研热点。随着研究的深入,诱导机制、诱导方法、诱导效率、临床应用以及建立不同物种诱导多能干细胞系等方面都得到显著的进展。目前,小鼠,大鼠,人类,恒河猴以及猪等物种的诱导多能干细胞系均已经成功建立。然而,成功建立绵羊诱导多能干细胞系的报道相对较少,并且效率低下。本研究通过逆转录病毒质粒传递系统,以小鼠来源的Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc 4个多能性基因以及miR-200c和miR-302 2个microRNA作为诱导因子,导入绵羊胚胎耳尖成纤维细胞,获得绵羊诱导多能性干细胞,并且进行多能性检测。为建立绵羊iPS细胞系方法的完善及探明绵羊iPSCs诱导机制奠定了基础。研究结果如下:1.诱导因子和实验细胞的准备:无内毒素提取携带Oct4、Sox2、klf4、c-Myc、miR-200c和miR-302的逆转录病毒载体,经过纯化进一步提高质粒浓度和纯度。双酶切鉴定后均出现理论长度的片段。应用胰酶消化法制备小鼠胚胎成纤维细胞和绵羊胚胎耳尖成纤维细胞。丝裂霉素C处理两种细胞制备饲养层。复苏包装病毒的Plat-E细胞。... 

【文章来源】：东北林业大学黑龙江省 211工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：53 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
1 绪论
    1.1 iPSCs的细胞特性
    1.2 诱导多能干细胞技术
    1.3 iPS细胞系的建立
        1.3.1 传统建立iPS细胞系的方法
        1.3.2 优化建立iPS细胞系的方法
        1.3.3 多物种的iPS细胞系建立
    1.4 iPSCs形成的分子机制
        1.4.1 多能性基因的激活
        1.4.2 多能性基因的转录调控
        1.4.3 表观遗传修饰的重编程
        1.4.4 重编程中的细胞信号通路
    1.5 iPSCs的鉴定
        1.5.1 形态学检测
        1.5.2 细胞生长特性检测
        1.5.3 碱性磷酸酶活性检测
        1.5.4 细胞特异性标记基因表达检测
        1.5.5 全基因组基因表达水平检测
        1.5.6 表观遗传学重编程的检测
        1.5.7 细胞分化潜能的检测
    1.6 iPSCs的应用
        1.6.1 疾病模型和药物开发中的应用
        1.6.2 组织器官工程中的应用
        1.6.3 受损组织修复中的应用
    1.7 研究意义
2 绵羊iPS细胞系的建立
    2.1 实验材料
        2.1.1 实验动物、实验细胞、实验质粒以及实验菌株
        2.1.2 主要试剂以及药品
        2.1.3 实验溶液的配制
        2.1.4 实验设备以及仪器
    2.2 实验方法
        2.2.1 多能性诱导因子的准备
        2.2.2 实验细胞的准备及培养
        2.2.3 诱导重编程因子的脂质体转染
        2.2.4 逆转录病毒的侵染
        2.2.5 iPSCs克隆的挑取
        2.2.6 iPSCs的扩增与培养
        2.2.7 iPSCs的鉴定
    2.3 实验结果
        2.3.1 诱导因子的准备及鉴定
        2.3.2 实验细胞的状态
        2.3.3 不同饲养层培养iPSCs的比较
        2.3.4 脂质体转染法的转染效率
        2.3.5 逆转录病毒的侵染效率
        2.3.6 iPSCs克隆的获取时间
        2.3.7 iPSCs的扩增与培养
        2.3.8 碱性磷酸酶染色
        2.3.9 免疫荧光染色
        2.3.10 甲基化检测
        2.3.11 甲基化水平差异
    2.4 讨论
结论
参考文献
攻读学位期间发表的学术论文
致谢



本文编号：2978113