鸭坦布苏病毒NS1蛋白的原核表达及其间接ELISA检测方法的建立
发布时间：2021-01-16 12:02
鸭坦布苏病毒病是由鸭坦布苏病毒（Duck Tembusu virus,DTMUV）引起以蛋鸭产蛋下降、雏鸭生长迟缓等为特征的新发传染病。2010年以来,在我国安徽、浙江、山东、江苏、福建等地区的鸭场中检测到DTMUV。该病毒已成为严重影响我国鸭群健康的新发病原体。NS1蛋白是DTMUV的非结构蛋白,主要与病毒RNA复制与致病作用有关,同时,NS1蛋白有多个抗原表位,能够诱导机体产生特异性抗体。根据DTMUV AH-F10株的全基因组序列（GenBank登录号:KM102539）设计一对引物,通过RT-PCR扩增NS1基因,构建NS1蛋白表达载体pET32a-NS1。将重组质粒pET32a-NS1转化到BL21大肠杆菌,经IPTG诱导表达,获得分子量大小为62 kDa的重组目的蛋白。重组表达蛋白包涵体经纯化、复性、浓缩后,SDS-PAGE和Western blotting分析鉴定,结果表明获得的重组NS1蛋白能与DTMUV阳性血清发生特异性反应。以纯化的重组NS1蛋白为包被抗原,通过优化包被浓度、封闭条件、血清稀释度、反应时间等,建立了基于NS1非结构蛋白的间接ELISA（NS1-ELI...
【文章来源】：安徽农业大学安徽省
【文章页数】：53 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
DTMUV结构模式
胚体会在 48~144 h 内死亡，胚体会出现水肿、出血、肝脏肿大并且驳状坏死等现象，而且绒毛尿囊膜增厚[6, 16-18]。病毒感染细胞最早可在接种察到细胞病变（Cytopathic effect, CPE），主要表现为细胞变圆，融合或者脱间隙扩大，培养基会变成黄色[19, 20]。 DTMUV 的基因组结构DTMUV 的基因组是不分节段的单股正链 RNA，大小约 10990bp[21, 22]。基5’端有Ⅰ型帽子结构（m7GpppAmp），3’端没有 poly（A）尾巴[23, 24]。整个组中只包含一个开放阅读框（Open reading frame, ORF），编码一个氨基酸minoacid, aa）含量为 3425 的多聚蛋白前体，该多聚蛋白前体经过宿主加工为成熟的功能蛋白，成熟的功能蛋白在信号肽的作用下可以水解为 10 个病其中包括 3 个结构蛋白，它们分别是核衣壳蛋白（C 蛋白）、外膜蛋白前体（）和囊膜蛋白（E 蛋白）；7 个非结构蛋白，分别是 NS1、NS2A、NS2B、NA、NS4B 和 NS5[25, 26]。开放阅读框的两端是高度结构化的非编码区（untransons, UTR），包括黄病毒大多数的保守序列，图 1-2[27]。
2- 1 NS1 基因 RT-PCR 扩增.2-1 RT-PCR results of NS1 g子质量标准；1：NS1 基因 P Marker ; 1: PCR products of提取质粒后进行双酶去上海生工公司测序bpM 115000bp5000000000501056 b
【参考文献】：
期刊论文
[1]坦布苏病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用[J]. 王楠楠,刘芳,许漩,张世伟,聂睿,殷冬冬,刘光清,王桂军. 中国兽医科学. 2015(01)
[2]禽坦布苏病毒感染的宿主及临床表现[J]. 黄瑜,苏荣茂,傅光华,万春和,陈红梅,傅秋玲,陈珍,施少华,程龙飞,林建生. 中国兽医杂志. 2014(11)
[3]黄病毒属病毒E蛋白结构和功能研究进展[J]. 寇甜甜,丁天兵. 微生物学免疫学进展. 2014(03)
[4]检测坦布苏病毒的双抗体夹心ELISA方法建立及初步应用[J]. 谢星星,李银,李祥瑞,赵冬敏,黄欣梅,韩凯凯,刘玉卓. 畜牧与兽医. 2014(05)
[5]检测鸭坦布苏病毒乳胶凝集试验的建立及初步应用[J]. 施少华,万春和,傅光华,程龙飞,陈红梅,傅秋玲,林建生,黄瑜. 福建农业学报. 2014(04)
[6]检测坦布苏病毒病抗体NS1-ELISA方法的建立与初步应用[J]. 谢星星,李祥瑞,李银,赵冬敏,黄欣梅,韩凯凯,刘宇卓,游园. 浙江农业学报. 2014(01)
[7]鹅源坦布苏病毒RT-LAMP快速检测方法的建立[J]. 韩凯凯,李银,黄欣梅,赵冬敏,刘宇卓,谢星星,游园. 浙江农业学报. 2014(01)
[8]鸭坦布苏病毒山东株的分离鉴定及其特性[J]. 葛平萍,刁有祥,唐熠,刘鑫,高绪慧,于春梅,曲俊姿. 中国兽医学报. 2014(01)
[9]鸭坦布苏病毒鸭胚成纤维细胞适应病毒编码基因序列测定及分析[J]. 李云霞,刘晓丽,张玥,韩宗玺,邵昱昊,刘胜旺,孔宪刚. 中国预防兽医学报. 2013(10)
[10]鸭坦布苏病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量检测方法的建立[J]. 万春和,朱海侠,施少华,黄瑜,程龙飞,傅光华,陈红梅. 中国兽医学报. 2013(07)
博士论文
[1]H9N2亚型禽流感病毒与鸭坦布苏病毒的生物学特性研究及疫苗的初步研制[D]. 徐大伟.内蒙古农业大学 2012
硕士论文
[1]坦布苏病毒SDS-70株弱毒苗的制备及安全性与免疫效力的初步评价[D]. 张欣.山东农业大学 2017
[2]鸭坦布苏病毒AH-F10株油乳剂灭活疫苗免疫效力评价[D]. 聂睿.安徽农业大学 2015
[3]坦布苏病毒NS5蛋白单克隆抗体的制备与鉴定及快速检测胶体金试纸条方法的建立[D]. 杨国平.山东农业大学 2015
[4]鸭坦布苏病毒FSD1株的生物学特性研究及基因组序列分析[D]. 杨英阁.山东农业大学 2014
[5]坦布苏病毒山东株SD/02的分离鉴定、DNA疫苗的构建及其免疫效果[D]. 曲俊姿.山东农业大学 2013
[6]鸭坦布苏病毒E蛋白单克隆抗体的制备及间接ELISA方法的建立[D]. 姬希文.内蒙古农业大学 2012
[7]鹅黄病毒JS804株生物学特性的研究及抗E蛋白单克隆抗体的制备与初步应用[D]. 钮慧敏.南京农业大学 2012
本文编号：2980793
【文章来源】：安徽农业大学安徽省
【文章页数】：53 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
DTMUV结构模式
胚体会在 48~144 h 内死亡，胚体会出现水肿、出血、肝脏肿大并且驳状坏死等现象，而且绒毛尿囊膜增厚[6, 16-18]。病毒感染细胞最早可在接种察到细胞病变（Cytopathic effect, CPE），主要表现为细胞变圆，融合或者脱间隙扩大，培养基会变成黄色[19, 20]。 DTMUV 的基因组结构DTMUV 的基因组是不分节段的单股正链 RNA，大小约 10990bp[21, 22]。基5’端有Ⅰ型帽子结构（m7GpppAmp），3’端没有 poly（A）尾巴[23, 24]。整个组中只包含一个开放阅读框（Open reading frame, ORF），编码一个氨基酸minoacid, aa）含量为 3425 的多聚蛋白前体，该多聚蛋白前体经过宿主加工为成熟的功能蛋白，成熟的功能蛋白在信号肽的作用下可以水解为 10 个病其中包括 3 个结构蛋白，它们分别是核衣壳蛋白（C 蛋白）、外膜蛋白前体（）和囊膜蛋白（E 蛋白）；7 个非结构蛋白，分别是 NS1、NS2A、NS2B、NA、NS4B 和 NS5[25, 26]。开放阅读框的两端是高度结构化的非编码区（untransons, UTR），包括黄病毒大多数的保守序列，图 1-2[27]。
2- 1 NS1 基因 RT-PCR 扩增.2-1 RT-PCR results of NS1 g子质量标准；1：NS1 基因 P Marker ; 1: PCR products of提取质粒后进行双酶去上海生工公司测序bpM 115000bp5000000000501056 b
【参考文献】：
期刊论文
[1]坦布苏病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用[J]. 王楠楠,刘芳,许漩,张世伟,聂睿,殷冬冬,刘光清,王桂军. 中国兽医科学. 2015(01)
[2]禽坦布苏病毒感染的宿主及临床表现[J]. 黄瑜,苏荣茂,傅光华,万春和,陈红梅,傅秋玲,陈珍,施少华,程龙飞,林建生. 中国兽医杂志. 2014(11)
[3]黄病毒属病毒E蛋白结构和功能研究进展[J]. 寇甜甜,丁天兵. 微生物学免疫学进展. 2014(03)
[4]检测坦布苏病毒的双抗体夹心ELISA方法建立及初步应用[J]. 谢星星,李银,李祥瑞,赵冬敏,黄欣梅,韩凯凯,刘玉卓. 畜牧与兽医. 2014(05)
[5]检测鸭坦布苏病毒乳胶凝集试验的建立及初步应用[J]. 施少华,万春和,傅光华,程龙飞,陈红梅,傅秋玲,林建生,黄瑜. 福建农业学报. 2014(04)
[6]检测坦布苏病毒病抗体NS1-ELISA方法的建立与初步应用[J]. 谢星星,李祥瑞,李银,赵冬敏,黄欣梅,韩凯凯,刘宇卓,游园. 浙江农业学报. 2014(01)
[7]鹅源坦布苏病毒RT-LAMP快速检测方法的建立[J]. 韩凯凯,李银,黄欣梅,赵冬敏,刘宇卓,谢星星,游园. 浙江农业学报. 2014(01)
[8]鸭坦布苏病毒山东株的分离鉴定及其特性[J]. 葛平萍,刁有祥,唐熠,刘鑫,高绪慧,于春梅,曲俊姿. 中国兽医学报. 2014(01)
[9]鸭坦布苏病毒鸭胚成纤维细胞适应病毒编码基因序列测定及分析[J]. 李云霞,刘晓丽,张玥,韩宗玺,邵昱昊,刘胜旺,孔宪刚. 中国预防兽医学报. 2013(10)
[10]鸭坦布苏病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量检测方法的建立[J]. 万春和,朱海侠,施少华,黄瑜,程龙飞,傅光华,陈红梅. 中国兽医学报. 2013(07)
博士论文
[1]H9N2亚型禽流感病毒与鸭坦布苏病毒的生物学特性研究及疫苗的初步研制[D]. 徐大伟.内蒙古农业大学 2012
硕士论文
[1]坦布苏病毒SDS-70株弱毒苗的制备及安全性与免疫效力的初步评价[D]. 张欣.山东农业大学 2017
[2]鸭坦布苏病毒AH-F10株油乳剂灭活疫苗免疫效力评价[D]. 聂睿.安徽农业大学 2015
[3]坦布苏病毒NS5蛋白单克隆抗体的制备与鉴定及快速检测胶体金试纸条方法的建立[D]. 杨国平.山东农业大学 2015
[4]鸭坦布苏病毒FSD1株的生物学特性研究及基因组序列分析[D]. 杨英阁.山东农业大学 2014
[5]坦布苏病毒山东株SD/02的分离鉴定、DNA疫苗的构建及其免疫效果[D]. 曲俊姿.山东农业大学 2013
[6]鸭坦布苏病毒E蛋白单克隆抗体的制备及间接ELISA方法的建立[D]. 姬希文.内蒙古农业大学 2012
[7]鹅黄病毒JS804株生物学特性的研究及抗E蛋白单克隆抗体的制备与初步应用[D]. 钮慧敏.南京农业大学 2012
本文编号：2980793
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