抑制性差减杂交技术筛选HPS潜在毒力基因及鉴别HPS潜在毒力菌株二重PCR方法的建立

发布时间：2021-01-23 00:11

　　副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis，HPS）可引起猪浆液纤维素性胸膜炎、心包炎、腹膜炎、关节炎及脑膜脑炎等症状。副猪嗜血杆菌病在全世界范围内广泛流行，成为威胁养猪业的重要疫病之一。本试验在2011年12月-2013年2月期间，对江西省多个地区的疑似病料进行HPS的分离鉴定及血清分型，从中选择代表菌株进行抑制性差减杂交来筛选差异基因，并进行分布调查，最后根据调查结果建立二重PCR用于临床上该菌的鉴定与毒力检测，具体如下：1、副猪嗜血杆菌的分离鉴定及血清分型在2011年12月-2013年2月期间，从江西多个地区的疑似病料中共分离鉴定出了39株HPS，这些菌株主要分离自肺脏（51.28%）、心脏（30.77%）、关节液（15.38%）和肝脏（2.56%）。将各分离株通过传统的Kielstein-Rapp-Gabrielson（KRG）分型方法进行血清分型，结果表明江西省HPS流行的血清型为5型（25.64%），13型（20.51%），4型（10.26%），12型（5.13%），15型（5.13%）。2、副猪嗜血杆菌潜在毒力基因的筛选采用抑制性差减杂交技术分别筛选高毒力13... 

【文章来源】：江西农业大学江西省

【文章页数】：69 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 文献综述
    1 副猪嗜血杆菌的研究进展
        1.1 副猪嗜血杆菌的生物学特性
        1.2 副猪嗜血杆菌病的研究现状
            1.2.1 副猪嗜血杆菌病流行病学
            1.2.2 副猪嗜血杆菌病的发病机理
            1.2.3 副猪嗜血杆菌病的临床症状
            1.2.4 副猪嗜血杆菌病的病理变化
            1.2.5 副猪嗜血杆菌病的诊治
        1.3 血清型研究
            1.3.1 血清分型
            1.3.2 血清型与毒力之间的关系
        1.4 毒力因子
            1.4.1 菌毛
            1.4.2 荚膜
            1.4.3 脂多糖
            1.4.4 外膜蛋白
            1.4.5 神经氨酸酶
            1.4.6 转铁蛋白
            1.4.7 毒力相关三聚自转运载体
            1.4.8 其他毒力因子相关研究
    2 抑制性差减杂交技术
        2.1 抑制性差减杂交技术原理
        2.2 抑制性差减杂交技术流程
            2.2.1 基因组的酶切
            2.2.2 接头的连接
            2.2.3 两轮差减杂交
            2.2.4 两次抑制性 PCR 反应
        2.3 抑制性差减杂交技术注意事项
        2.4 抑制性差减杂交技术在细菌毒力研究中的应用
            2.4.1 毒力岛或遗传岛的发现
            2.4.2 毒力基因的筛选
            2.4.4 基因表达上的变化
第二章 江西省副猪嗜血杆菌的分离鉴定及血清分型
    1 材料与方法
        1.1 材料
            1.1.1 病料及血清来源
            1.1.2 主要试剂
        1.2 方法
            1.2.1 副猪嗜血杆菌的分离鉴定
            1.2.2 副猪嗜血杆菌的血清分型
    2 结果
        2.1 细菌的分离培养
        2.2 生化试验
        2.3 PCR 鉴定
        2.4 江西分离株概况
        2.5 血清分型结果
    3 讨论
第三章 副猪嗜血杆菌潜在毒力基因的筛选
    1 材料与方法
        1.1 材料
            1.1.1 菌株、载体和质粒
            1.1.2 主要试剂
            1.1.3 培养基
            1.1.4 Southern blot 缓冲液的配制
            1.1.5 试验用引物
        1.2 方法
            1.2.1 试验菌株基因组的提取
            1.2.2 基因组的酶切
            1.2.3 抑制性差减杂交
            1.2.4 差减文库的构建
            1.2.5 斑点杂交试验对差异基因的筛选
            1.2.6 差异基因的测序、对比、分析
    2 结果
        2.1 基因组的提取
        2.2 酶切基因组
        2.3 接头的连接
        2.4 抑制性差减杂交
        2.5 差减效率检测
        2.6 差减文库构建
        2.7 斑点杂交试验
            2.7.1 JX1108 和 HS197 斑点杂交结果
            2.7.2 HPJX9 和 HS81 斑点杂交结果
        2.8 筛选的差异片段的测序及分析
            2.8.1 JX1108 和 HS197 差异片段的测序及分析
            2.8.2 HPJX9 和 HS81 差异片段的测序及分析
    3 讨论
第四章 副猪嗜血杆菌潜在毒力基因的分布调查
    1 材料与方法
        1.1 材料
            1.1.1 菌株
            1.1.2 培养基
            1.1.3 试剂
            1.1.4 引物
        1.2 方法
            1.2.1 模板的制备
            1.2.2 潜在毒力基因在参考菌株中分布调查
            1.2.3 毒力偏向性基因在江西地方分离株中的分布调查
    2 结果
        2.1 潜在毒力基因在参考菌株中的分布
            2.1.1 JX1108 与 HS197 的潜在毒力基因在参考菌株中的分布
            2.1.2 HPJX9 与 HS81 的潜在毒力基因在参考菌株中的分布
        2.2 毒力偏向性基因在江西地方分离株中的分布
            2.2.1 JX1108 与 HS197 筛选的毒力偏向性基因在江西地方分离株中的分布
            2.2.2 HPJX9 与 HS81 筛选的毒力偏向性基因在江西地方分离株中的分布
    3 讨论
第五章 鉴别副猪嗜血杆菌潜在毒株的二重 PCR 方法的建立
    1 材料与方法
        1.1 材料
            1.1.1 菌种
            1.1.2 主要试剂
        1.2 方法
            1.2.1 引物设计
            1.2.2 基因组 DNA 的提取
            1.2.3 引物特异性试验
            1.2.4 引物对参考株的检测
            1.2.5 二重 PCR 条件的优化
            1.2.6 二重 PCR 特异性试验
            1.2.7 二重 PCR 敏感性试验
            1.2.8 二重 PCR 对参考株的检测
            1.2.9 二重 PCR 的初步应用
    2 结果
        2.1 引物特异性
        2.2 引物对参考株的检测
        2.3 二重 PCR 条件的优化
        2.4 二重 PCR 的特异性
        2.5 二重 PCR 的敏感性
        2.6 二重 PCR 对参考株的检测
        2.7 二重 PCR 的初步应用
    3 讨论
全文总结
参考文献
致谢



本文编号：2994166