日本脑炎病毒样颗粒疫苗及双氧水灭活疫苗的探讨性研究

发布时间：2021-01-31 19:15

　　猪乙型脑炎病原为日本脑炎病毒（Japanese encephalitis virus, JEV）,属于黄病毒科（Flaviviridae）黄病毒属,该属包括黄热病（Yellow fever virus）、日本乙脑病毒（JEV）、西尼罗河病毒（West nile virus）和登革热病毒（Degue virus）等多种严重危害人畜健康的病毒。目前预防猪乙型脑炎主要靠接种疫苗和防蚊灭蚊。本研究初步探索了乙型脑炎颗粒疫苗以及新型乙脑病毒灭活剂的效果,HBC是乙型肝炎核心抗原,其在多种表达体系中均被表达并能自组装成病毒样颗粒,是一种良好的表位展示免疫载体。另外据报道作为病毒灭活剂的双氧水能快速有效灭活病毒,并且对病毒表面结构的破坏相对传统灭活剂-甲醛要小很多,本实验对以双氧水为灭活剂的猪乙型脑炎灭活苗进行初步研究。1展示JEV EDIII loop3表位的病毒样颗粒的制备及其免疫效果研究JEV E蛋白结构域Ⅲ（EDⅢ）是诱导中和抗体的重要区域。据报道,体外实验表明EDIII的一个环肽（loop3）能通过干扰病毒吸附细胞抑制病毒感染,接种该蛋白之后对小鼠的攻毒实验表明loop3是保护性最强的一段... 

【文章来源】：南京农业大学江苏省 211工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：91 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
目录
摘要
ABSTRACT
缩略语表
第一篇 文献综述
    第一章 猪流行性乙型脑炎的研究进展
        1 猪流行性乙型脑炎分子生物学特征
            1.1 病原学特征
            1.2 流行病学特征
            1.3 临床症状和病理变化特征
                1.3.1 临床症状
                1.3.2 病理变化
        2 猪流行性乙型脑炎病毒基因组的结构特征
            2.1 结构蛋白
                2.1.1 C蛋白
                2.1.2 prM/M蛋白
                2.1.3 E蛋白
            2.2 非结构蛋白
        3 流行性乙型脑炎病毒的分类和分型
        4 流行性乙型脑炎病毒的毒力和致病机理
            4.1 流行性乙型脑炎病毒的毒力影响因素
            4.2 流行性乙型脑炎病毒的致病机理
        5 流行性乙型脑炎病毒的诊断方法
            5.1 临床诊断
            5.2 病原学诊断
            5.3 血清学诊断
                5.3.1 酶联免疫吸附试验（ELISA）
                5.3.2 免疫荧光检测法（IFA法）
                5.3.3 血凝抑制试验
            5.4 分子生物学检测
                5.4.1 逆转录—聚合酶链式反应技术（RT-PCR）
                5.4.2 基因芯片技术
                5.4.3 实时荧光PCR（Real-Time PCR）
        6 流行性乙型脑炎病毒疫苗的研究进展
            6.1 灭活疫苗
            6.2 减毒活疫苗
            6.3 基因工程疫苗
                6.3.1 基因工程亚单位疫苗
                6.3.2 基因工程重组活载体疫苗
                6.3.3 核酸疫苗
                6.3.4 合成肽疫苗
    第二章 HBc颗粒疫苗的研究进展
        1 乙肝核心抗原的结构特征
        2 HBcAg的免疫学优势
        3 HBeAg颗粒作为免疫载体研究进展
    参考文献
第二篇 研究内容
    第三章 重组原核质粒pET28a-HBC-loop3的构建及HBC-loop3蛋白的表达
        摘要
        1 材料与方法
            1.1 细菌与载体
            1.2 主要试剂、工具酶及仪器
            1.3 重组原核表达载体的构建
                1.3.1 目的基因的扩增
                1.3.2 DNA小量胶回收试剂盒提取凝胶中的DNA
                1.3.3 目的基因连接pMD18-T载体
                1.3.4 阳性克隆的筛选
                1.3.5 载体和基因片段的连接反应及转化
                1.3.6 阳性质粒的鉴定
            1.4 转化Rosetta-2大肠杆菌感受态及阳性筛选
            1.5 阳性质粒的筛选和鉴定
            1.6 蛋白表达及纯化
                1.6.1 IPTG低温诱导表达
                1.6.2 超声波裂解菌体
                1.6.3 表达产物的可溶性分析
                1.6.4 蛋白纯化
                1.6.5 纯化重组蛋白HBC-loop3的SDS-聚丙烯酸胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析
        2 结果
            2.1 目的基因的扩增结果
            2.2 双酶切获得基因片段和载体
            2.3 pET-28a-HBc-loop3阳性质粒的鉴定
            2.4 重组质粒转化PCR鉴定
            2.5 表达产物的分析
            2.6 重组蛋白纯化效果SDS-PAGE分析
            2.7 电镜观察
            2.8 纯化重组蛋白HBC-loop3的Western Blotting分析结果
        3. 小结
        Abstract
        参考文献
    第四章 展示JEV EDIII loop3表位抗原的病毒样颗粒免疫原性的研究
        摘要
        1 材料
            1.1 蛋白、病毒和细胞
            1.2 主要试剂和仪器
            1.3 实验动物
        2 方法
            2.1 动物分组及免疫程序
            2.2 检测JEV抗体的间接ELISA方法的初步建立
                2.2.1 最适抗原包被浓度和血清稀释度的确定
                2.2.2 抗原包被最适条件的确定
                2.2.3 最佳封闭条件的确定
                2.2.4 一抗最适工作时间的选择
                2.2.5 酶标抗体工作时间的选择
                2.2.6 底物作用时间的选择
                2.2.7 结果判定临界值的选择
                2.2.8 符合性试验
                2.2.9 重复性试验
            2.3 ELISA法检测血清抗体
            2.4 血凝及血凝抑制实验
                2.4.1 病毒抗原制备
                2.4.2 血清处理
                2.4.3 鹅红细胞的制备
                2.4.4 血凝抑制试验
            2.5 蚀斑减少实验检测血清中和抗体滴度
                2.5.1 蚀斑形成试验
                2.5.2 蚀斑减少中和试验
                2.5.3 结果判定
        3 结果
            3.1 颗粒疫苗接种小鼠的健康状况
            3.2 HBC-loop3颗粒抗原免疫小鼠血清抗体检测（ELISA法）
            3.3 血凝与血凝抑制反应测抗体结果
            3.4 空斑减少实验测血清中和抗体
        4 小结
        Abstract
        参考文献
    第五章 过氧化氢作为日本脑炎灭活苗灭活剂的效果研究
        摘要
        1 材料
            1.1 材料
                1.1.1 病毒和细胞
                1.1.2 主要试剂和仪器
                1.1.4 实验动物
        2 方法
            2.1 乙脑病毒的纯化
                2.1.1 病毒的扩增
                2.1.2 蔗糖密度梯度离心纯化病毒
            2.2 病毒的灭活及灭活效果的检测
            2.3 乙脑灭活苗的制备
            2.4 接种免疫
                2.4.1 首次免疫
                2.4.2 二次免疫
        3 灭活抗原免疫效果评价
            3.1 间接ELISA检测血清抗体滴度
            3.2 血凝抑制试验检测抗体
            3.3 蚀斑减少实验检测血清中和抗体滴度
        4 结果
            4.1 乙脑病毒抗原的制备
            4.2 病毒抗原纯化的结果
            4.3 病毒灭活效果的检测结果
            4.4 灭活疫苗接种小鼠的健康状况
            4.5 双氧水灭活乙脑抗原ELISA抗体效价检测结果
            4.6 血凝抑制（HI）实验结
            4.7 空斑抑制试验验结果
        5 小结
        Abstract
        参考文献
全文总结
附录
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]猪流行性乙型脑炎病毒种猪精液分离株的鉴定及进化分析[J]. 王兴涛,罗俊,滕蔓,樊剑鸣,鄂巍,禹斌,刘力,张改平.  河南农业科学. 2011(05)
[2]日本乙型脑炎病毒的研究进展[J]. 李一生,朱长清.  饲料博览. 2011(03)
[3]乙型脑炎病毒（JEV）ELISA检测方法的建立[J]. 王吉,卫礼,巩薇,高正琴,岳秉飞,贺争鸣.  中国比较医学杂志. 2010(08)
[4]检测猪乙型脑炎病毒抗体间接ELISA方法的建立与应用[J]. 沈婷,周斌,陈溥言.  畜牧与兽医. 2010(04)
[5]近年来我国流行性乙型脑炎研究进展[J]. 蔡宝祥.  畜牧与兽医. 2009(08)
[6]中国东北地区3株日本脑炎病毒株的分离鉴定及基因分型[J]. 张永欣,符芳,宋淑萍,李曦,吴东来.  东北农业大学学报. 2009(06)
[7]猪乙型脑炎病毒的研究进展[J]. 房献忠,付强,张清华,房杰良.  中国畜禽种业. 2008(19)
[8]流行性乙型脑炎病毒E蛋白结构域Ⅲ的抗原表位鉴定与功能研究[J]. 闫丽萍,华荣虹,亓文宝,童光志.  生物化学与生物物理进展. 2008(03)
[9]辽宁省乙型脑炎病毒分离及进化树分析[J]. 王作虪,安淑一,王燕,韩悦,郭军巧.  中国公共卫生. 2008(03)
[10]流行性乙型脑炎病毒及其研究进展[J]. 郭杨,郭万柱.  预防医学情报杂志. 2008(01)

硕士论文
[1]日本乙型脑炎实验室诊断方法的研究和应用[D]. 孙圣福.华中农业大学 2004



本文编号：3011438