抗牛病毒性腹泻病毒Erns蛋白单克隆抗体制备及鉴定
发布时间：2021-02-01 05:50
牛病毒性腹泻/黏膜病是影响全世界养牛业的重要疾病,BVDV病毒亚型众多、宿主范围广。动物感染病毒后可引起机体免疫抑制,导致继发感染。BVDV是黄病毒科瘟病毒属RNA病毒;BVDV分为1种血清型,2种生物型和3种基因型。该病毒主要引起牛腹泻病、呼吸道疾病、生产性能下降等临床症状。BVDV还严重影响与牛相关的生物制品,如冻精、血清、抗体、疫苗等,对畜牧业国家造成严重的经济损失。我国自1980年在吉林省长春地区检测到BVDV病毒以来,全国感染动物阳性率逐年增加,最新数据显示我国BVDV阳性率已达到46.7%,持续性感染率达2.2%,严重阻碍畜牧业发展。因此探索BVDV阳性动物检测方法,消除BVDV传染源,对减少生产损失是有实际意义的。基于此本研究主要开展并完成了以下试验:1.BVDV Erns和E2全长基因克隆及序列生物信息学分析MDBK细胞增殖BVDV病毒,然后提取病毒RNA;设计Erns和E2基因全长引物,RT-PCR扩增目的基因;基因克隆载体后菌落PCR验证,最后测序,进行生物信息学分析。结果表明:试验成功扩增681 bp Erns全长基因片段;生物信息学预测Erns基因序列编码227...
【文章来源】：甘肃农业大学甘肃省
【文章页数】：73 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
正常MDBK细胞Fig.2-1NormalMDBKcells
抗牛病毒性腹泻病毒Erns蛋白单克隆抗体制备及鉴定17图2-3BVDVRT-PCR扩增的琼脂糖凝胶电泳Fig.2-3AgarosegelelectrophoresisamplifiedbyBVDVRT-PCRM：Mark；1：5’UTR扩增产物；2：鉴定引物扩增产物M:Mark;1:5"UTRAmplificationproducts;2:Identificationofprimeramplificationproducts2.3Erns、E2全长基因PCR扩增2.3.1Erns基因PCR产物及克隆PCR反应扩增得到特异性条带，大小为681bp（图2-4），与预期结果一致；菌液PCR鉴定结果均为681bp（图2-5），选取3个阳性克隆送测序，结果表明所选3个克隆Erns基因序列一致；NCBIBLAST结果显示扩增序列为BVDV-Ι型序列，相似度99%，证明试验成功获得Erns基因全长。图2-4Erns全长基因PCR扩增的琼脂糖凝胶电泳Fig.2-4AgarosegelelectrophoresiswithPCRamplificationofErnsfull-lengthgeneM：Mark；1：681bp扩增产物M:Mark;1:681bpamplificationproducts图2-5Erns全长基因阳性克隆菌PCR扩增的琼脂糖凝胶电泳Fig.2-5PCRamplificationoffull-lengthErnsgenepositiveclonesbyagarosegelelectrophoresisM：Mark；1-10：pMD19-T-ErnsPCR产物M:Mark;1-10:pMD19-T-ErnsPCRproducts
抗牛病毒性腹泻病毒Erns蛋白单克隆抗体制备及鉴定17图2-3BVDVRT-PCR扩增的琼脂糖凝胶电泳Fig.2-3AgarosegelelectrophoresisamplifiedbyBVDVRT-PCRM：Mark；1：5’UTR扩增产物；2：鉴定引物扩增产物M:Mark;1:5"UTRAmplificationproducts;2:Identificationofprimeramplificationproducts2.3Erns、E2全长基因PCR扩增2.3.1Erns基因PCR产物及克隆PCR反应扩增得到特异性条带，大小为681bp（图2-4），与预期结果一致；菌液PCR鉴定结果均为681bp（图2-5），选取3个阳性克隆送测序，结果表明所选3个克隆Erns基因序列一致；NCBIBLAST结果显示扩增序列为BVDV-Ι型序列，相似度99%，证明试验成功获得Erns基因全长。图2-4Erns全长基因PCR扩增的琼脂糖凝胶电泳Fig.2-4AgarosegelelectrophoresiswithPCRamplificationofErnsfull-lengthgeneM：Mark；1：681bp扩增产物M:Mark;1:681bpamplificationproducts图2-5Erns全长基因阳性克隆菌PCR扩增的琼脂糖凝胶电泳Fig.2-5PCRamplificationoffull-lengthErnsgenepositiveclonesbyagarosegelelectrophoresisM：Mark；1-10：pMD19-T-ErnsPCR产物M:Mark;1-10:pMD19-T-ErnsPCRproducts
【参考文献】：
期刊论文
[1]我国单克隆抗体药物注册申报现状分析[J]. 阚红金,刘伯宁,白玉,罗建辉. 中国新药杂志. 2019(16)
[2]口蹄疫病毒VP2蛋白特异性单克隆工程抗体的表达与活性鉴定[J]. 王省,李坤,卢曾军,刘在新,李冬,包慧芳,李平花,孙普,白兴文,陈应理,付元芳,张婧,马雪青,曹轶梅. 中国兽医科学. 2019(08)
[3]单克隆抗体在抗病毒感染中的研究进展[J]. 卜桐,崔乐乐,刘兆基,张涵旭,史雨,李爱梅,考文萍,翟爱霞. 现代生物医学进展. 2019(06)
[4]我国单克隆抗体药物产业化进展浅谈[J]. 陶维红,李宗海,李荣秀. 生物产业技术. 2019(02)
[5]基于单抗捕获牛病毒性腹泻病毒（BVDV）抗原ELISA方法的建立及应用[J]. 胡俊英,鲁海冰,常晓冉,李欣,马振乾,郭昌明,张泽财,王新平. 中国兽医学报. 2019(03)
[6]牛病毒性腹泻病毒抗体胶体金检测试纸条的制备[J]. 梅力,杨春江,韦海涛,于在江,李志军,陈会玲,杨小强,高晓龙,王林,冯小宇. 中国兽医杂志. 2019(02)
[7]单个B细胞制备CRP单克隆抗体及其ELISA检测体系的初步建立[J]. 林骏,山云,刘谦,王晓炜,王洪涛,刘尧. 中国免疫学杂志. 2019(01)
[8]全人源单克隆抗体制备技术的研究进展[J]. 唐亚华,胡慧明,朱美玲. 现代医药卫生. 2018(23)
[9]牛病毒性腹泻病毒E1蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备[J]. 康彪,高闪电,独军政,田占成,殷宏,胡永浩. 动物医学进展. 2018(11)
[10]一株白牦牛源牛病毒性腹泻病毒E0基因的原核表达与序列分析[J]. 马鹏,李林杰,常秋燕,王悦萦,马晓霞,马忠仁. 西南农业学报. 2018(09)
博士论文
[1]牛病毒性腹泻病毒基因组分析及LDLR敲除对其侵染牛肾细胞的影响[D]. 才冬杰.中国农业大学 2018
[2]牛病毒性腹泻病毒诱导的细胞自噬对病毒感染影响机制研究[D]. 周玉龙.吉林大学 2017
[3]牛病毒性腹泻病毒感染形成和复制的分子机制研究[D]. 宫晓炜.中国农业科学院 2014
[4]牛病毒性腹泻病毒抗原检测、流行病学研究及分离株E2基因的克隆表达[D]. 钟发刚.四川农业大学 2008
[5]鹿源BVDV分离鉴定、E0基因的克隆与表达及免疫原性研究[D]. 郜玉钢.吉林农业大学 2005
硕士论文
[1]小反刍兽疫病毒甘肃分离株F基因的克隆、原核表达及单克隆抗体的制备[D]. 肖敏.甘肃农业大学 2017
[2]稳定表达牛病毒性腹泻病毒衣壳蛋白牛肾细胞株构建[D]. 张子琪.天津科技大学 2017
[3]牛病毒性腹泻病毒（BVDV）E2蛋白纳米抗体筛选及其功能的初步研究[D]. 黄美玲.石河子大学 2016
[4]基于脂蛋白P48的牛支原体快速检测方法的建立[D]. 胡国明.甘肃农业大学 2015
[5]非洲猪瘟病毒p54重组蛋白的原核表达及其单克隆抗体制备[D]. 冯尧.扬州大学 2014
[6]牛病毒性腹泻粘膜病病毒E2基因的克隆、表达及间接ELISA方法的初步建立[D]. 刘昱成.石河子大学 2014
[7]牛病毒性腹泻病毒囊膜蛋白Erns/E2的原核表达及噬菌体展示anti-BVDV纳米抗体文库的构建[D]. 肖红冉.石河子大学 2013
[8]牛病毒性腹泻黏膜病实用诊断方法的建立[D]. 王研.西南民族大学 2013
[9]基于噬菌体展示技术的副猪嗜血杆菌的抗体文库构建[D]. 吴康乐.南昌大学 2012
[10]牛病毒性腹泻病毒RT-PCR方法的建立与gP48基因克隆及原核表达[D]. 李宁.河北农业大学 2012
本文编号：3012283
【文章来源】：甘肃农业大学甘肃省
【文章页数】：73 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
正常MDBK细胞Fig.2-1NormalMDBKcells
抗牛病毒性腹泻病毒Erns蛋白单克隆抗体制备及鉴定17图2-3BVDVRT-PCR扩增的琼脂糖凝胶电泳Fig.2-3AgarosegelelectrophoresisamplifiedbyBVDVRT-PCRM：Mark；1：5’UTR扩增产物；2：鉴定引物扩增产物M:Mark;1:5"UTRAmplificationproducts;2:Identificationofprimeramplificationproducts2.3Erns、E2全长基因PCR扩增2.3.1Erns基因PCR产物及克隆PCR反应扩增得到特异性条带，大小为681bp（图2-4），与预期结果一致；菌液PCR鉴定结果均为681bp（图2-5），选取3个阳性克隆送测序，结果表明所选3个克隆Erns基因序列一致；NCBIBLAST结果显示扩增序列为BVDV-Ι型序列，相似度99%，证明试验成功获得Erns基因全长。图2-4Erns全长基因PCR扩增的琼脂糖凝胶电泳Fig.2-4AgarosegelelectrophoresiswithPCRamplificationofErnsfull-lengthgeneM：Mark；1：681bp扩增产物M:Mark;1:681bpamplificationproducts图2-5Erns全长基因阳性克隆菌PCR扩增的琼脂糖凝胶电泳Fig.2-5PCRamplificationoffull-lengthErnsgenepositiveclonesbyagarosegelelectrophoresisM：Mark；1-10：pMD19-T-ErnsPCR产物M:Mark;1-10:pMD19-T-ErnsPCRproducts
抗牛病毒性腹泻病毒Erns蛋白单克隆抗体制备及鉴定17图2-3BVDVRT-PCR扩增的琼脂糖凝胶电泳Fig.2-3AgarosegelelectrophoresisamplifiedbyBVDVRT-PCRM：Mark；1：5’UTR扩增产物；2：鉴定引物扩增产物M:Mark;1:5"UTRAmplificationproducts;2:Identificationofprimeramplificationproducts2.3Erns、E2全长基因PCR扩增2.3.1Erns基因PCR产物及克隆PCR反应扩增得到特异性条带，大小为681bp（图2-4），与预期结果一致；菌液PCR鉴定结果均为681bp（图2-5），选取3个阳性克隆送测序，结果表明所选3个克隆Erns基因序列一致；NCBIBLAST结果显示扩增序列为BVDV-Ι型序列，相似度99%，证明试验成功获得Erns基因全长。图2-4Erns全长基因PCR扩增的琼脂糖凝胶电泳Fig.2-4AgarosegelelectrophoresiswithPCRamplificationofErnsfull-lengthgeneM：Mark；1：681bp扩增产物M:Mark;1:681bpamplificationproducts图2-5Erns全长基因阳性克隆菌PCR扩增的琼脂糖凝胶电泳Fig.2-5PCRamplificationoffull-lengthErnsgenepositiveclonesbyagarosegelelectrophoresisM：Mark；1-10：pMD19-T-ErnsPCR产物M:Mark;1-10:pMD19-T-ErnsPCRproducts
【参考文献】：
期刊论文
[1]我国单克隆抗体药物注册申报现状分析[J]. 阚红金,刘伯宁,白玉,罗建辉. 中国新药杂志. 2019(16)
[2]口蹄疫病毒VP2蛋白特异性单克隆工程抗体的表达与活性鉴定[J]. 王省,李坤,卢曾军,刘在新,李冬,包慧芳,李平花,孙普,白兴文,陈应理,付元芳,张婧,马雪青,曹轶梅. 中国兽医科学. 2019(08)
[3]单克隆抗体在抗病毒感染中的研究进展[J]. 卜桐,崔乐乐,刘兆基,张涵旭,史雨,李爱梅,考文萍,翟爱霞. 现代生物医学进展. 2019(06)
[4]我国单克隆抗体药物产业化进展浅谈[J]. 陶维红,李宗海,李荣秀. 生物产业技术. 2019(02)
[5]基于单抗捕获牛病毒性腹泻病毒（BVDV）抗原ELISA方法的建立及应用[J]. 胡俊英,鲁海冰,常晓冉,李欣,马振乾,郭昌明,张泽财,王新平. 中国兽医学报. 2019(03)
[6]牛病毒性腹泻病毒抗体胶体金检测试纸条的制备[J]. 梅力,杨春江,韦海涛,于在江,李志军,陈会玲,杨小强,高晓龙,王林,冯小宇. 中国兽医杂志. 2019(02)
[7]单个B细胞制备CRP单克隆抗体及其ELISA检测体系的初步建立[J]. 林骏,山云,刘谦,王晓炜,王洪涛,刘尧. 中国免疫学杂志. 2019(01)
[8]全人源单克隆抗体制备技术的研究进展[J]. 唐亚华,胡慧明,朱美玲. 现代医药卫生. 2018(23)
[9]牛病毒性腹泻病毒E1蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备[J]. 康彪,高闪电,独军政,田占成,殷宏,胡永浩. 动物医学进展. 2018(11)
[10]一株白牦牛源牛病毒性腹泻病毒E0基因的原核表达与序列分析[J]. 马鹏,李林杰,常秋燕,王悦萦,马晓霞,马忠仁. 西南农业学报. 2018(09)
博士论文
[1]牛病毒性腹泻病毒基因组分析及LDLR敲除对其侵染牛肾细胞的影响[D]. 才冬杰.中国农业大学 2018
[2]牛病毒性腹泻病毒诱导的细胞自噬对病毒感染影响机制研究[D]. 周玉龙.吉林大学 2017
[3]牛病毒性腹泻病毒感染形成和复制的分子机制研究[D]. 宫晓炜.中国农业科学院 2014
[4]牛病毒性腹泻病毒抗原检测、流行病学研究及分离株E2基因的克隆表达[D]. 钟发刚.四川农业大学 2008
[5]鹿源BVDV分离鉴定、E0基因的克隆与表达及免疫原性研究[D]. 郜玉钢.吉林农业大学 2005
硕士论文
[1]小反刍兽疫病毒甘肃分离株F基因的克隆、原核表达及单克隆抗体的制备[D]. 肖敏.甘肃农业大学 2017
[2]稳定表达牛病毒性腹泻病毒衣壳蛋白牛肾细胞株构建[D]. 张子琪.天津科技大学 2017
[3]牛病毒性腹泻病毒（BVDV）E2蛋白纳米抗体筛选及其功能的初步研究[D]. 黄美玲.石河子大学 2016
[4]基于脂蛋白P48的牛支原体快速检测方法的建立[D]. 胡国明.甘肃农业大学 2015
[5]非洲猪瘟病毒p54重组蛋白的原核表达及其单克隆抗体制备[D]. 冯尧.扬州大学 2014
[6]牛病毒性腹泻粘膜病病毒E2基因的克隆、表达及间接ELISA方法的初步建立[D]. 刘昱成.石河子大学 2014
[7]牛病毒性腹泻病毒囊膜蛋白Erns/E2的原核表达及噬菌体展示anti-BVDV纳米抗体文库的构建[D]. 肖红冉.石河子大学 2013
[8]牛病毒性腹泻黏膜病实用诊断方法的建立[D]. 王研.西南民族大学 2013
[9]基于噬菌体展示技术的副猪嗜血杆菌的抗体文库构建[D]. 吴康乐.南昌大学 2012
[10]牛病毒性腹泻病毒RT-PCR方法的建立与gP48基因克隆及原核表达[D]. 李宁.河北农业大学 2012
本文编号：3012283
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