牛源产气荚膜梭菌的分离鉴定与α、β2、ε毒素基因的原核表达
发布时间:2021-02-02 03:37
牛产气荚膜梭菌病主要由A型、C型和D型产气荚膜梭菌引发,对畜牧业的危害极大,尚无有效的防控措施。本研究拟通过克隆及原核表达A型产气荚膜梭菌α毒素基因、C型产气荚膜梭菌β2毒素基因及D型产气荚膜梭菌ε毒素基因,为研制基因工程疫苗奠定基础。临床分离鉴定牛源产气荚膜梭菌17株,经单因子毒素ELISA检测及多重PCR分型,最终鉴定出A型产气荚膜梭菌10株、C型产气荚膜梭菌4株、D型产气荚膜梭菌3株。通过小鼠半数致死量试验选择毒力强的菌株进行后续实验。克隆α、β2及ε毒素基因片段,构建克隆载体pMD18-T-α、pMD18-T-β2和pMD18-T-ε。将鉴定正确的基因片段分别插入到原核表达载体pET-32a(+)中,构建毒素基因原核表达载体pET-32a(+)-α、pET-32a(+)-β2和pET-32a(+)-ε,将构建正确的重组表达载体导入到大肠杆菌BL21(DE3)菌株中,经IPTG诱导,Western blot检测表达蛋白的反应原性。结果表明,成功构建克隆载体pMD18-T-α、pMD18-T-β2和pMD18-T-ε,目的基因片段分别为 1092 bp、987 bp 和 798 b...
【文章来源】:内蒙古民族大学内蒙古自治区
【文章页数】:49 页
【学位级别】:硕士
【部分图文】:
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【参考文献】:
期刊论文
[1]E型产气荚膜梭菌ι毒素重组质粒的构建与表达[J]. 黄静,王琳,张括川,刘晓丹,赵宝华. 动物医学进展. 2015(07)
[2]牛产气荚膜梭菌α-ε毒素基因的融合表达及其纯化[J]. 尹辉,赵达,陈为宏,高佳滨,乔波,陈楠楠,胡旭,梁鸿儒,姜东君,王鹤,朱战波. 中国生物制品学杂志. 2015(03)
[3]产气荚膜梭菌α-β2-ε毒素融合蛋白在大肠杆菌中的表达及免疫原性研究[J]. 宫旭颖,葛俊伟,乔薪瑗,唐丽杰,姜艳平,崔文,李一经. 中国预防兽医学报. 2015(02)
[4]产气荚膜梭菌α毒素和ε毒素的共表达及其免疫原性的研究[J]. 韩广伟,李兆才,宫晓炜,陈启伟,曹小安,郑福英,张小英,周继章. 中国兽医科学. 2014(06)
[5]用SPSS软件计算鼠疫菌半数致死量(LD50)[J]. 熊浩明,魏柏青,魏荣杰,杨宁海,祁美英,靳娟,金泳,何建,代瑞霞. 中国人兽共患病学报. 2013(11)
[6]湖北石首野生麋鹿种群大量死亡原因调查[J]. 张林源,温华军,钟震宇,李鹏飞,王文,李坤,沙平. 畜牧与兽医. 2011(04)
[7]产气荚膜梭菌β2毒素基因的克隆及定点突变[J]. 王玉炯,许崇波,蒋玉文,邓光存,曾瑾,马春燕. 中国生物制品学杂志. 2004(06)
[8]我国魏氏梭菌病的流行特点[J]. 张红英,卢中华,杨霞,王亚宾,金钺. 中国畜牧兽医. 2004(01)
本文编号:3013976
【文章来源】:内蒙古民族大学内蒙古自治区
【文章页数】:49 页
【学位级别】:硕士
【部分图文】:
图1病牛剖检?
?内蒙古民族大学硕士学位论文?15??室温孵育2?h;??(7)二抗孵育结束后,TBST洗涤条带5次,8?min/次;??(8)显影:按照碧云天ECL超敏显影液试剂盒说明书将A液和B液1:1混合,??避光保存,将条带放入Tanon?2500凝胶成像系统观察。??3实验结果??3.1产气荚膜梭菌的分离与鉴定??3.1.1临床症状及剖检结果??病牛卧地不起,饮食欲废绝,逐渐死亡,剖检可见腹部鼓气,脾脏肿大,肾脏??肿大,肝脏有出血点,胸腔、腹腔和心包有积液,空肠和回肠严重出血,肠系膜有??出血点(图1和图2)。??图1病牛剖检?图2牛肠道病变??Fig.l?Necropsy?of?dieased?cattle?Fig.2?Intestinal?lesions?in?cattle??3.1.2培养及染色特性??在血琼脂平板上37°C培养18-24?h,形成圆形、光滑、边缘整齐的菌落,多数菌??株有双圈溶血环,内环完全溶血,外环不完全溶血。在牛奶培养基内可见汹涌发酵(图??3)。在显微镜下可观察到革兰氏阳性粗大杆菌,大小约为两端顿圆,??单个或成双排列,芽孢椭圆形,直径小于菌体,位于菌体中央或次级端,有荚膜,无??鞭毛(图4)。??
_16?牛源产气荚膜梭菌的分离鉴定与cu?p2>?s毒素基因的原核表达???图3分离菌牛奶培养基培养?图4革兰氏染色镜检(1000倍)??Fig.3?Isolated?strains?were?cultured?in?milk?medium?Fig.4?Gram?stain?microscopy?(1000x)??3.1.3菌株的生化鉴定结果??分离菌株均能发酵葡萄糖、乳糖、麦芽糖和蔗糖,产酸产气,不发酵甘露醇和水??杨苷,明胶、H2S和卵磷脂试验均为阳性,脂酶试验阴性。菌株的生化特性符合产气??荚膜梭菌的生化特性,置信度为99%,具体结果见表11。??表11菌株生化试验结果??Tab.?11?Strain?biochemical?test?results??生化试验?结果?生化试验?结果??Biochemical?tests?Results?Biochemical?tests?Results??卵黄琼脂(LEC)?+?葡萄糖(glucose)?+??卵黄琼脂(LIP)?-?麦芽糖(maltose)?+??口弓陳(Benzazole)?-?甘露醇(Mannitol)?-??鹿糖(Sucrose)?+?山梨醇(Sorbitol)?-??鼠李糖(Rhamnose)?-?硝酸盐(Nitrate)?-??靛基质(Indole)?-?尿素(Urea)?-??木糖(Xylose)?-?阿拉伯糖(Arabinose)?-??七叶灵(Esculine)?-?乳糖(Lactose)?+??纤维二糖(Cellose)?-?松三糖(Melezitose)?-?
【参考文献】:
期刊论文
[1]E型产气荚膜梭菌ι毒素重组质粒的构建与表达[J]. 黄静,王琳,张括川,刘晓丹,赵宝华. 动物医学进展. 2015(07)
[2]牛产气荚膜梭菌α-ε毒素基因的融合表达及其纯化[J]. 尹辉,赵达,陈为宏,高佳滨,乔波,陈楠楠,胡旭,梁鸿儒,姜东君,王鹤,朱战波. 中国生物制品学杂志. 2015(03)
[3]产气荚膜梭菌α-β2-ε毒素融合蛋白在大肠杆菌中的表达及免疫原性研究[J]. 宫旭颖,葛俊伟,乔薪瑗,唐丽杰,姜艳平,崔文,李一经. 中国预防兽医学报. 2015(02)
[4]产气荚膜梭菌α毒素和ε毒素的共表达及其免疫原性的研究[J]. 韩广伟,李兆才,宫晓炜,陈启伟,曹小安,郑福英,张小英,周继章. 中国兽医科学. 2014(06)
[5]用SPSS软件计算鼠疫菌半数致死量(LD50)[J]. 熊浩明,魏柏青,魏荣杰,杨宁海,祁美英,靳娟,金泳,何建,代瑞霞. 中国人兽共患病学报. 2013(11)
[6]湖北石首野生麋鹿种群大量死亡原因调查[J]. 张林源,温华军,钟震宇,李鹏飞,王文,李坤,沙平. 畜牧与兽医. 2011(04)
[7]产气荚膜梭菌β2毒素基因的克隆及定点突变[J]. 王玉炯,许崇波,蒋玉文,邓光存,曾瑾,马春燕. 中国生物制品学杂志. 2004(06)
[8]我国魏氏梭菌病的流行特点[J]. 张红英,卢中华,杨霞,王亚宾,金钺. 中国畜牧兽医. 2004(01)
本文编号:3013976
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