表达PCV2-Cap蛋白和PPV1-VP2蛋白的重组伪狂犬病病毒的构建及其免疫原性研究
发布时间：2021-02-05 21:48
猪圆环病毒2型（Porcine circovirus 2,PCV2）、猪细小病毒1型（Porcine parvovirus type 1,PPV1）和伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus,PRV）是三种最重要的猪病原体,并常混合感染,给养猪业造成巨大的经济损失。近年来出现的PRV变异株对伪狂犬病的临床防控提出新的挑战。因此,研制安全有效的防制这三种疫病的疫苗具有重要科学价值。Cap蛋白和VP2蛋白分别为PCV2和PPV1的主要免疫保护性抗原,是研制基因工程疫苗理想的靶蛋白。PRV作为活载体表达外源保护性抗原成为基因工程疫苗的研究热点。本研究旨在构建高水平表达PCV2-Cap蛋白和PPV1-VP2蛋白的重组伪狂犬病病毒,为防制这三种病毒性疾病提供基因工程候选疫苗株。为了构建表达PCV2-Cap蛋白和PPV1-VP2蛋白的重组病毒,选择非必需基因TK基因作为插入位点。以重组质粒pMD18T-LR（TK）-EGFP为骨架,首先将密码子优化的PPV1-VP2基因替换EGFP,构建重组质粒pMD18T-LR（TK）-VP2opti,同时将PRV-gG信号肽序列...
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：50 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
重组病毒的构建示意图
测序结果表明重组质粒 pMD18T-LR(TK)-VP2opti和 pMD18T-LR(TK重组质粒 pMD18T-LR(TK)-VP2opti和 pMD18T-LR(TK)-VP2opti(SP)转染 2FA 结果显示 PPV1-VP2 蛋白在 PK-15 细胞中获得表达（图 2.3）。00 DNA Marker; 1: R-arm(ClaⅠ/Hind Ⅲ); 2: VP2opti-His expression cassette (SpeⅠ/ClaⅠ); 3: L-arm(Ec4: R-arm(ClaⅠ/Hind Ⅲ); 5: gGsp-VP2opti-His expression cassette (SpeⅠ/ClaⅠ); 6: L-arm(EcoRⅠ/SpeⅠ图 2.2 含 VP2 表达盒的重组质粒酶切分析Fig. 2.2 Restriction analysis of recombinant plasmids containing VP2 expression cassetteA: pMD18T-LR(TK)-VP2opti酶切分析；B: pMD18T-LR(TK)-VP2opti(SP)酶切分析iction analysis of pMD18T-LR(TK)-VP2optiB: Restriction analysis of pMD18T-LR(TK)-V
国农业科学院硕士学位论文 第二章 表达PCV2-Cap蛋白和PPV1-VP2蛋白的重组伪狂犬病病毒的2.2 表达 EGFP 蛋白和 Cap 蛋白的重组病毒的构建与鉴定将重组质粒 pMD18T-LR(TK)-EGFP 和重组病毒 rPRV-TK-/gE-/gG-/3Cap+基因组共转染 PK胞后，72 h 后在倒置荧光显微镜下观察到了带有许多绿色荧光的细胞病变。共转染产物反 2 次后，经 1: 10 系列稀释法进行蚀斑纯化，经过 16 轮蚀斑克隆，将得的纯化重组病毒命V-TK-/EGFP+/gE-/gG-/2Cap+（图 2.4）。提取每轮重组病毒的基因组 DNA，用通用引物 P5F P4F/P4R（表 2.2）分别进行扩增，结果显示在第 6、8、10、12、14 和 16 轮重组病毒基均扩增出大小约 1800 bp 片段（图 2.5 A），表明 EGFP 表达盒能够稳定存在于重组病V-TK-/EGFP+/gE-/gG-/2Cap+的基因组中。在第 16 轮重组病毒的 6 个克隆中均未扩增出大2 bp 片段（图 2.5 B），表明 Cap 基因被替换。
【参考文献】：
期刊论文
[1]表达猪细小病毒VP2蛋白的重组猪伪狂犬病毒在小鼠体内的免疫反应[J]. 付朋飞,潘鑫龙,乔涵,杨兴武,朱前磊,郭晓庆,张宇,陈红英. 病毒学报. 2016(02)
[2]共表达PCV2 ORF2和猪IL-18基因的重组猪伪狂犬病毒对小鼠的免疫原性[J]. 郭晓庆,朱前磊,潘鑫龙,杨兴武,乔涵,王淑娟,陈红英. 微生物学报. 2016(01)
[3]猪细小病毒1型VP2蛋白的表达与单克隆抗体的制备及应用[J]. 孙建慧,黄立平,危艳武,吴洪丽,王一平,张辉,刘丹,陈冬杰,张智慧,刘长明. 中国兽医科学. 2014(12)
[4]猪圆环病毒2型灭活疫苗（LG株）的研制与应用[J]. 刘长明,危艳武,陆月华,黄立平,吴洪丽,张朝霞,温士刚,姜凤娟. 畜牧兽医科技信息. 2010(09)
[5]伪狂犬病病毒主要毒力基因对其致细胞病变能力的影响[J]. 朱玲,郭万柱,王印,阳爱国,石恬,徐凯,赵玲. 中国兽医科学. 2009(11)
[6]猪细小病毒VP2基因核酸疫苗的构建及免疫原性[J]. 王印,王新,郭万柱. 中国兽医学报. 2009(05)
[7]IL-2与猪细小病毒VP2基因双表达载体的构建及免疫原性的研究[J]. 崔保安,魏战勇,王学斌,黄克和,金喜新,董振杰,郑兰兰. 生物工程学报. 2006(03)
[8]猪圆环病毒2型细胞培养适应毒株的培育和鉴定[J]. 刘长明,张超范,危艳武,谭斌,陆月华,谷守林. 中国预防兽医学报. 2006(03)
[9]猪细小病毒结构蛋白VP1和VP2的基因免疫研究[J]. 赵俊龙,陈焕春,吕建强,王祥,肖少波,周复春. 病毒学报. 2003(01)
[10]猪细小病毒灭活疫苗的安全性和免疫力[J]. 潘雪珠,粟寿初,张婉华,严仲烈,叶向阳,杨水奶,唐骐骏,余晨,曹伟民. 上海农业学报. 1988(01)
博士论文
[1]猪乙型脑炎病毒—细小病毒—伪狂犬病毒活载体疫苗的研究[D]. 陈弟诗.四川农业大学 2011
硕士论文
[1]表达PCV2-Cap蛋白的TK-/gE-/gG-重组伪狂犬病毒的构建及其免疫原性研究[D]. 夏德利.中国农业科学院 2017
[2]表达猪圆环病毒2型（PCV2）Cap蛋白重组伪狂犬病病毒的构建及其生物学特性鉴定[D]. 杜文娟.中国农业科学院 2016
[3]猪圆环病毒2型ORF2基因在昆虫杆状病毒表达系统的表达及亚单位疫苗的初步研究[D]. 张家明.河南农业大学 2010
本文编号：3019632
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：50 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
重组病毒的构建示意图
测序结果表明重组质粒 pMD18T-LR(TK)-VP2opti和 pMD18T-LR(TK重组质粒 pMD18T-LR(TK)-VP2opti和 pMD18T-LR(TK)-VP2opti(SP)转染 2FA 结果显示 PPV1-VP2 蛋白在 PK-15 细胞中获得表达（图 2.3）。00 DNA Marker; 1: R-arm(ClaⅠ/Hind Ⅲ); 2: VP2opti-His expression cassette (SpeⅠ/ClaⅠ); 3: L-arm(Ec4: R-arm(ClaⅠ/Hind Ⅲ); 5: gGsp-VP2opti-His expression cassette (SpeⅠ/ClaⅠ); 6: L-arm(EcoRⅠ/SpeⅠ图 2.2 含 VP2 表达盒的重组质粒酶切分析Fig. 2.2 Restriction analysis of recombinant plasmids containing VP2 expression cassetteA: pMD18T-LR(TK)-VP2opti酶切分析；B: pMD18T-LR(TK)-VP2opti(SP)酶切分析iction analysis of pMD18T-LR(TK)-VP2optiB: Restriction analysis of pMD18T-LR(TK)-V
国农业科学院硕士学位论文 第二章 表达PCV2-Cap蛋白和PPV1-VP2蛋白的重组伪狂犬病病毒的2.2 表达 EGFP 蛋白和 Cap 蛋白的重组病毒的构建与鉴定将重组质粒 pMD18T-LR(TK)-EGFP 和重组病毒 rPRV-TK-/gE-/gG-/3Cap+基因组共转染 PK胞后，72 h 后在倒置荧光显微镜下观察到了带有许多绿色荧光的细胞病变。共转染产物反 2 次后，经 1: 10 系列稀释法进行蚀斑纯化，经过 16 轮蚀斑克隆，将得的纯化重组病毒命V-TK-/EGFP+/gE-/gG-/2Cap+（图 2.4）。提取每轮重组病毒的基因组 DNA，用通用引物 P5F P4F/P4R（表 2.2）分别进行扩增，结果显示在第 6、8、10、12、14 和 16 轮重组病毒基均扩增出大小约 1800 bp 片段（图 2.5 A），表明 EGFP 表达盒能够稳定存在于重组病V-TK-/EGFP+/gE-/gG-/2Cap+的基因组中。在第 16 轮重组病毒的 6 个克隆中均未扩增出大2 bp 片段（图 2.5 B），表明 Cap 基因被替换。
【参考文献】：
期刊论文
[1]表达猪细小病毒VP2蛋白的重组猪伪狂犬病毒在小鼠体内的免疫反应[J]. 付朋飞,潘鑫龙,乔涵,杨兴武,朱前磊,郭晓庆,张宇,陈红英. 病毒学报. 2016(02)
[2]共表达PCV2 ORF2和猪IL-18基因的重组猪伪狂犬病毒对小鼠的免疫原性[J]. 郭晓庆,朱前磊,潘鑫龙,杨兴武,乔涵,王淑娟,陈红英. 微生物学报. 2016(01)
[3]猪细小病毒1型VP2蛋白的表达与单克隆抗体的制备及应用[J]. 孙建慧,黄立平,危艳武,吴洪丽,王一平,张辉,刘丹,陈冬杰,张智慧,刘长明. 中国兽医科学. 2014(12)
[4]猪圆环病毒2型灭活疫苗（LG株）的研制与应用[J]. 刘长明,危艳武,陆月华,黄立平,吴洪丽,张朝霞,温士刚,姜凤娟. 畜牧兽医科技信息. 2010(09)
[5]伪狂犬病病毒主要毒力基因对其致细胞病变能力的影响[J]. 朱玲,郭万柱,王印,阳爱国,石恬,徐凯,赵玲. 中国兽医科学. 2009(11)
[6]猪细小病毒VP2基因核酸疫苗的构建及免疫原性[J]. 王印,王新,郭万柱. 中国兽医学报. 2009(05)
[7]IL-2与猪细小病毒VP2基因双表达载体的构建及免疫原性的研究[J]. 崔保安,魏战勇,王学斌,黄克和,金喜新,董振杰,郑兰兰. 生物工程学报. 2006(03)
[8]猪圆环病毒2型细胞培养适应毒株的培育和鉴定[J]. 刘长明,张超范,危艳武,谭斌,陆月华,谷守林. 中国预防兽医学报. 2006(03)
[9]猪细小病毒结构蛋白VP1和VP2的基因免疫研究[J]. 赵俊龙,陈焕春,吕建强,王祥,肖少波,周复春. 病毒学报. 2003(01)
[10]猪细小病毒灭活疫苗的安全性和免疫力[J]. 潘雪珠,粟寿初,张婉华,严仲烈,叶向阳,杨水奶,唐骐骏,余晨,曹伟民. 上海农业学报. 1988(01)
博士论文
[1]猪乙型脑炎病毒—细小病毒—伪狂犬病毒活载体疫苗的研究[D]. 陈弟诗.四川农业大学 2011
硕士论文
[1]表达PCV2-Cap蛋白的TK-/gE-/gG-重组伪狂犬病毒的构建及其免疫原性研究[D]. 夏德利.中国农业科学院 2017
[2]表达猪圆环病毒2型（PCV2）Cap蛋白重组伪狂犬病病毒的构建及其生物学特性鉴定[D]. 杜文娟.中国农业科学院 2016
[3]猪圆环病毒2型ORF2基因在昆虫杆状病毒表达系统的表达及亚单位疫苗的初步研究[D]. 张家明.河南农业大学 2010
本文编号：3019632
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