METTL21C介导IGF2BP1赖氨酸甲基化修饰调控鸡成肌细胞增殖机制研究
发布时间：2021-02-09 05:12
甲基转移酶样21C（Methyltransferase like 21C,METTL21C）属于赖氨酸甲基转移酶,在哺乳动物骨骼肌组织中特异性高表达,并参与维持骨骼肌稳态,但其在家禽骨骼肌中的研究相对较少。本研究以液相色谱质谱（LC-MS/MS）筛选出的METTL21C互作蛋白为依据,挑选互作蛋白中与细胞增殖密切相关的胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白1（Insulin-like growth factor 2 mRNA-binding protein 1,IGF2BP1）为研究对象,验证METTL21C与IGF2BP1的蛋白质互作关系,进而分析METTL21C介导IGF2BP1的甲基化修饰作用;以鸡成肌细胞为模型,研究METTL21C甲基化修饰IGF2BP1对鸡成肌细胞增殖的影响,在蛋白质修饰水平揭示METTL21C介导IGF2BP1的甲基化影响鸡成肌细胞增殖的分子机制,为解析METTL21C在家禽骨骼肌生长发育中的功能提供参考。本研究主要获得实验结果如下:1.基于LC-MS/MS质谱检测结果,筛选IGF2BP1为研究对象,成功构建pCDNA3.1-HA-Igf2bp1融合超表达载...
【文章来源】：陕西理工大学陕西省
【文章页数】：74 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
HA-Igf2bp1片段的PCR扩增Fig.2-1PCRamplificationofHA-Igf2bp1fragment
陕西理工大学硕士学位论文-18-注：M：DNA标准MarkerDL2000；1号泳道为PCR扩增产物。2.3.1.2Igf2bp1基因片段TA克隆鉴定将纯化的HA-Igf2bp1片段连接至pMD19-T载体并进行转化，菌落PCR检测随机挑取的10个单克隆，结果显示3号和7号两个泳道扩增出与预期结果（1927bp）大小一致的条带，为阳性克隆（图2-2A）；经测序验证，存在3个点突变，但均为同义突变，结果表明克隆获得HA-Igf2bp1基因片段（图2-2B）。图2-2菌落PCR及测序鉴定Fig.2-2IdentificationofcolonyPCRandsequencing注：A：菌落PCR结果；M：DNA标准MarkerDL2000；1-10号泳道为菌落PCR产物；B：测序结果。2.3.1.3pCDNA3.1-HA-Igf2bp1重组载体鉴定将测序正确的HA-Igf2bp1片段连接至pCDNA3.1骨架载体，转化后通过菌落PCR对连接产物进行检测，发现10个单克隆菌落均扩增出目标大小条带（1908bp），表明均为阳性克隆（图2-3A）。通过BamHI和EcoRI对随机选取的阳性克隆质粒进行双酶切验证，结果发现，pCDNA3.1-HA-Igf2bp1重组质粒被BamHI和EcoRI切开并且条带大小正确，说明HA-Igf2bp1基因片段已插入pCDNA3.1骨架载体中，即pCDNA3.1-HA-Igf2bp1重组载体构建成功（图2-3B），载体质粒图谱见图2-3C。
第2章METTL21C与IGF2BP1蛋白质互作研究-19-图2-3pCDNA3.1-HA-Igf2bp1重组载体鉴定Fig.2-3IdentificationofpCDNA3.1-HA-Igf2bp1recombinantvector注：A：菌落PCR鉴定结果；M：DNA标准MarkerDL2000；1-10号泳道为10个单菌落PCR产物；B：酶切验证结果；M：DL5000Marker；1号泳道为未酶切质粒，2号泳道为双酶切产物；C：pCDNA3.1-HA-Igf2bp1重组质粒示意图。2.3.2Igf2bp1超表达效率鉴定将Igf2bp1超表达载体转染至鸡成肌细胞，采用qPCR和WesternBlot技术分别检测Igf2bp1的超表达效率。qPCR结果显示：与空载组相比，超表达组的Igf2bp1mRNA表达水平显著升高，超表达效率为13.4倍（图2-4A）。蛋白水平分别采用HA和IGF2BP1两种抗体进行检测，WesternBlot结果显示：用HA抗体孵育时，由于超表达载体携带HA标签，出现明显条带；而空载体中未携带HA标签，因此未出现条带（图2-4B），说明超表达外源基因能够进行表达。用IGF2BP1抗体孵育时，超表达组的IGF2BP1蛋白表达水平显著高于对照组（图2-4C）。表明pCDNA3.1-HA-Igf2bp1载体能够在鸡成肌细胞中表达。图2-4Igf2bp1超表达效率Fig.2-4Igf2bp1overexpressionefficiency
本文编号：3025104
【文章来源】：陕西理工大学陕西省
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【学位级别】：硕士
【部分图文】：
HA-Igf2bp1片段的PCR扩增Fig.2-1PCRamplificationofHA-Igf2bp1fragment
陕西理工大学硕士学位论文-18-注：M：DNA标准MarkerDL2000；1号泳道为PCR扩增产物。2.3.1.2Igf2bp1基因片段TA克隆鉴定将纯化的HA-Igf2bp1片段连接至pMD19-T载体并进行转化，菌落PCR检测随机挑取的10个单克隆，结果显示3号和7号两个泳道扩增出与预期结果（1927bp）大小一致的条带，为阳性克隆（图2-2A）；经测序验证，存在3个点突变，但均为同义突变，结果表明克隆获得HA-Igf2bp1基因片段（图2-2B）。图2-2菌落PCR及测序鉴定Fig.2-2IdentificationofcolonyPCRandsequencing注：A：菌落PCR结果；M：DNA标准MarkerDL2000；1-10号泳道为菌落PCR产物；B：测序结果。2.3.1.3pCDNA3.1-HA-Igf2bp1重组载体鉴定将测序正确的HA-Igf2bp1片段连接至pCDNA3.1骨架载体，转化后通过菌落PCR对连接产物进行检测，发现10个单克隆菌落均扩增出目标大小条带（1908bp），表明均为阳性克隆（图2-3A）。通过BamHI和EcoRI对随机选取的阳性克隆质粒进行双酶切验证，结果发现，pCDNA3.1-HA-Igf2bp1重组质粒被BamHI和EcoRI切开并且条带大小正确，说明HA-Igf2bp1基因片段已插入pCDNA3.1骨架载体中，即pCDNA3.1-HA-Igf2bp1重组载体构建成功（图2-3B），载体质粒图谱见图2-3C。
第2章METTL21C与IGF2BP1蛋白质互作研究-19-图2-3pCDNA3.1-HA-Igf2bp1重组载体鉴定Fig.2-3IdentificationofpCDNA3.1-HA-Igf2bp1recombinantvector注：A：菌落PCR鉴定结果；M：DNA标准MarkerDL2000；1-10号泳道为10个单菌落PCR产物；B：酶切验证结果；M：DL5000Marker；1号泳道为未酶切质粒，2号泳道为双酶切产物；C：pCDNA3.1-HA-Igf2bp1重组质粒示意图。2.3.2Igf2bp1超表达效率鉴定将Igf2bp1超表达载体转染至鸡成肌细胞，采用qPCR和WesternBlot技术分别检测Igf2bp1的超表达效率。qPCR结果显示：与空载组相比，超表达组的Igf2bp1mRNA表达水平显著升高，超表达效率为13.4倍（图2-4A）。蛋白水平分别采用HA和IGF2BP1两种抗体进行检测，WesternBlot结果显示：用HA抗体孵育时，由于超表达载体携带HA标签，出现明显条带；而空载体中未携带HA标签，因此未出现条带（图2-4B），说明超表达外源基因能够进行表达。用IGF2BP1抗体孵育时，超表达组的IGF2BP1蛋白表达水平显著高于对照组（图2-4C）。表明pCDNA3.1-HA-Igf2bp1载体能够在鸡成肌细胞中表达。图2-4Igf2bp1超表达效率Fig.2-4Igf2bp1overexpressionefficiency
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