禽白血病病毒p27基因在毕赤酵母中表达及间接ELISA检测方法的建立与应用
发布时间：2021-02-16 01:48
禽白血病（Avian Leukosis）是由禽白血病病毒（Avian Leukosis Virus,ALV）引起的具有传染性的肿瘤性疾病。该病以水平和垂直两种方式传播,目前暂无可用疫苗以及有效的治疗药物,在世界各国养禽业广泛流行,危害严重。种群净化、降低感染率是防制病毒传播的主要方式。禽白血病被列入2012～2020年国家中长期动物疫病防治规划中的优先防治病种之一。因而,建立快速、有效的禽白血病检测方法对于临床诊断、监测、净化是十分必要的。p27蛋白是禽白血病基因组中基因编码的群特异性抗原,是ALV核心衣壳蛋白的主要成分,有很多病毒抗原位点,常常作为检测抗体的首选。本研究利用酵母表达系统对ALVp27基因进行表达,并且以该蛋白为包被抗原建立了禽白血病间接ELISA检测方法,为p27蛋白的大规模生产以及禽白血病检测试剂盒的进一步研制提供理论基础。禽白血病p27基因在毕赤酵母中的表达根据Gene Bank中已发表的禽白血病基因全序列中p27基因的序列,用PrimerPremeir5.0软件设计含EcoR I和Not I酶切位点的一对特异性引物,以ALVRNA为模板,RT-PCR扩增目的基因...
【文章来源】：延边大学吉林省 211工程院校
【文章页数】：51 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
前言
1 禽白血病的研究进展
1.1 禽白血病的病原学
1.2 禽白血病的流行病学
1.3 临床症状与病理变化
1.4 禽白血病的检测方法
1.5 禽白血病的防控
2 毕赤酵母表达系统的研究进展
2.1 酵母表达系统
2.2 毕赤酵母表达的菌株
2.3 毕赤酵母的载体
2.4 影响外源蛋白表达的主要因素
3 研究的目的与意义
材料与方法
1 材料
1.1 毒株、细胞与血清
1.2 载体与工具酶
1.3 主要试剂与试剂盒
1.4 主要溶液与培养基配制
2 方法
2.1 禽白血病病毒p27基因在毕赤酵母中的表达
2.2 禽白血病间接ELISA检测方法的建立
结果
1 p27基因表达的结果
1.1 p27基因PCR扩增结果
1.2 pMD-p27克隆质粒的双酶切鉴定
1.3 测序结果分析
1.4 pPIC9K-p27酵母表达株的鉴定
1.5 毕赤酵母转化子的PCR鉴定
1.6 p27蛋白的鉴定结果
1.7 蛋白表达条件的优化
1.8 p27蛋白的纯化结果
2 间接ELISA方法建立的结果
2.1 最佳抗原包被浓度和血清的稀释度确定
2.2 二抗稀释度的确定
2.3 封闭剂的确定
2.4 封闭时间的确定
2.5 待检血清最佳作用时间的确定
2.6 二抗最佳反应时间确定
2.7 最佳显色时间的确定
2.8 阴阳性临界值的确定
2.9 符合性试验
2.10 特异性试验
2.11 重复性试验
2.12 临床样本检测结果
讨论
结论
参考文献
致谢
作者简介
附录
【参考文献】：
期刊论文
[1]ELISA检测方法在禽白血病净化中的应用[J]. 王广龙,王皓然,王勇,王钊哲,戴健涛,王晓枫,徐家付,姜梦,白文顺,杨亮宇,汪善荣. 中兽医学杂志. 2017(01)
[2]禽白血病的防控措施[J]. 王洪娟. 中国畜牧兽医文摘. 2017(02)
[3]禽白血病研究进展[J]. 李浩然. 养禽与禽病防治. 2017(01)
[4]应用荧光定量RT-PCR检测J亚群禽白血病病毒[J]. 屈素洁,邹联斌,陈芳芳,张步娴,胡杰,莫胜兰,施开创,李军,尹彦文. 中国动物检疫. 2015(06)
[5]PCR法检测活毒疫苗中禽白血病病毒污染[J]. 胡晓苗,沈学怀,戴银,赵瑞宏,侯宏艳,潘孝成,周学利,张丹俊,朱传明. 中国兽医杂志. 2014(09)
[6]基于密码子优化的蛋白酶K在毕赤酵母中的表达及分离纯化[J]. 孙风敏,韩焱,李文利. 微生物学通报. 2014(11)
[7]规模化种禽场禽白血病检测方法的比较及初步应用[J]. 奚德华,梁有志,尹丽萍,王姣,辜新贵,阎晓东,庄新娟,钱琨,秦爱建,刘岳龙. 中国家禽. 2014(03)
[8]J亚群禽白血病病毒gp85基因的原核表达及间接ELISA方法建立[J]. 刘丽娜,邵华斌,程国富,杨峻,张琳,谢华丽,栗绍文,罗青平. 中国预防兽医学报. 2014(01)
[9]毕赤酵母表达系统研究进展[J]. 马银鹏,王玉文,党阿丽,孔祥辉,张介驰. 黑龙江科学. 2013(09)
[10]J亚群禽白血病病毒gp85基因在毕赤酵母中的分泌表达[J]. 徐延伟,高宏雷,高玉龙,李凯,高立,秦立廷,祁小乐,王永强,王笑梅. 中国畜牧兽医. 2012(04)
博士论文
[1]禽白血病病毒抗原/抗体ELISA检测方法的建立及准种分析[D]. 毛娅卿.中国农业大学 2014
[2]毕赤酵母表达系统及其应用[D]. 郭雨刚.中国科学技术大学 2012
[3]A亚群禽白血病病毒不同分离株的基因组和生物学特性比较[D]. 张青婵.山东农业大学 2010
硕士论文
[1]人骨形态蛋白2在毕赤酵母中的表达和生物活性测定[D]. 王娜娜.天津工业大学 2017
[2]禽白血病病毒衣壳蛋白p27生物学功能的初步研究[D]. 胡海.扬州大学 2016
[3]里氏木霉β-甘露聚糖酶的克隆表达及结构域的研究[D]. 蔡瑞.天津科技大学 2016
[4]四川部分地区J亚型禽白血病分子流行病学调查及一株ALV-J流行株对ND-IB活疫苗免疫反应的影响[D]. 余松城.四川农业大学 2014
[5]密码子优化的蛋白酶K在毕赤酵母中的表达及分离纯化[D]. 孙风敏.大连理工大学 2014
[6]山东地方品种鸡寿光鸡禽白血病流行特点及病理学研究[D]. 毛翠.山东农业大学 2013
[7]地方品种BR鸡原种鸡群禽白血病的监测及其检测材料的对比评估[D]. 王秀臻.山东农业大学 2013
[8]葡萄漆酶的毕赤酵母异源表达纯化及酶学特性与功能研究[D]. 林亚虬.南京农业大学 2013
[9]禽白血病病毒逆转录环介导等温扩增检测方法的研究[D]. 邢秀皎.中国兽医药品监察所 2011
[10]山东地区禽白血病发病鸡群的流行病学调查及致病特性的研究[D]. 杨凤.山东农业大学 2011
本文编号：3035921
【文章来源】：延边大学吉林省 211工程院校
【文章页数】：51 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
前言
1 禽白血病的研究进展
1.1 禽白血病的病原学
1.2 禽白血病的流行病学
1.3 临床症状与病理变化
1.4 禽白血病的检测方法
1.5 禽白血病的防控
2 毕赤酵母表达系统的研究进展
2.1 酵母表达系统
2.2 毕赤酵母表达的菌株
2.3 毕赤酵母的载体
2.4 影响外源蛋白表达的主要因素
3 研究的目的与意义
材料与方法
1 材料
1.1 毒株、细胞与血清
1.2 载体与工具酶
1.3 主要试剂与试剂盒
1.4 主要溶液与培养基配制
2 方法
2.1 禽白血病病毒p27基因在毕赤酵母中的表达
2.2 禽白血病间接ELISA检测方法的建立
结果
1 p27基因表达的结果
1.1 p27基因PCR扩增结果
1.2 pMD-p27克隆质粒的双酶切鉴定
1.3 测序结果分析
1.4 pPIC9K-p27酵母表达株的鉴定
1.5 毕赤酵母转化子的PCR鉴定
1.6 p27蛋白的鉴定结果
1.7 蛋白表达条件的优化
1.8 p27蛋白的纯化结果
2 间接ELISA方法建立的结果
2.1 最佳抗原包被浓度和血清的稀释度确定
2.2 二抗稀释度的确定
2.3 封闭剂的确定
2.4 封闭时间的确定
2.5 待检血清最佳作用时间的确定
2.6 二抗最佳反应时间确定
2.7 最佳显色时间的确定
2.8 阴阳性临界值的确定
2.9 符合性试验
2.10 特异性试验
2.11 重复性试验
2.12 临床样本检测结果
讨论
结论
参考文献
致谢
作者简介
附录
【参考文献】：
期刊论文
[1]ELISA检测方法在禽白血病净化中的应用[J]. 王广龙,王皓然,王勇,王钊哲,戴健涛,王晓枫,徐家付,姜梦,白文顺,杨亮宇,汪善荣. 中兽医学杂志. 2017(01)
[2]禽白血病的防控措施[J]. 王洪娟. 中国畜牧兽医文摘. 2017(02)
[3]禽白血病研究进展[J]. 李浩然. 养禽与禽病防治. 2017(01)
[4]应用荧光定量RT-PCR检测J亚群禽白血病病毒[J]. 屈素洁,邹联斌,陈芳芳,张步娴,胡杰,莫胜兰,施开创,李军,尹彦文. 中国动物检疫. 2015(06)
[5]PCR法检测活毒疫苗中禽白血病病毒污染[J]. 胡晓苗,沈学怀,戴银,赵瑞宏,侯宏艳,潘孝成,周学利,张丹俊,朱传明. 中国兽医杂志. 2014(09)
[6]基于密码子优化的蛋白酶K在毕赤酵母中的表达及分离纯化[J]. 孙风敏,韩焱,李文利. 微生物学通报. 2014(11)
[7]规模化种禽场禽白血病检测方法的比较及初步应用[J]. 奚德华,梁有志,尹丽萍,王姣,辜新贵,阎晓东,庄新娟,钱琨,秦爱建,刘岳龙. 中国家禽. 2014(03)
[8]J亚群禽白血病病毒gp85基因的原核表达及间接ELISA方法建立[J]. 刘丽娜,邵华斌,程国富,杨峻,张琳,谢华丽,栗绍文,罗青平. 中国预防兽医学报. 2014(01)
[9]毕赤酵母表达系统研究进展[J]. 马银鹏,王玉文,党阿丽,孔祥辉,张介驰. 黑龙江科学. 2013(09)
[10]J亚群禽白血病病毒gp85基因在毕赤酵母中的分泌表达[J]. 徐延伟,高宏雷,高玉龙,李凯,高立,秦立廷,祁小乐,王永强,王笑梅. 中国畜牧兽医. 2012(04)
博士论文
[1]禽白血病病毒抗原/抗体ELISA检测方法的建立及准种分析[D]. 毛娅卿.中国农业大学 2014
[2]毕赤酵母表达系统及其应用[D]. 郭雨刚.中国科学技术大学 2012
[3]A亚群禽白血病病毒不同分离株的基因组和生物学特性比较[D]. 张青婵.山东农业大学 2010
硕士论文
[1]人骨形态蛋白2在毕赤酵母中的表达和生物活性测定[D]. 王娜娜.天津工业大学 2017
[2]禽白血病病毒衣壳蛋白p27生物学功能的初步研究[D]. 胡海.扬州大学 2016
[3]里氏木霉β-甘露聚糖酶的克隆表达及结构域的研究[D]. 蔡瑞.天津科技大学 2016
[4]四川部分地区J亚型禽白血病分子流行病学调查及一株ALV-J流行株对ND-IB活疫苗免疫反应的影响[D]. 余松城.四川农业大学 2014
[5]密码子优化的蛋白酶K在毕赤酵母中的表达及分离纯化[D]. 孙风敏.大连理工大学 2014
[6]山东地方品种鸡寿光鸡禽白血病流行特点及病理学研究[D]. 毛翠.山东农业大学 2013
[7]地方品种BR鸡原种鸡群禽白血病的监测及其检测材料的对比评估[D]. 王秀臻.山东农业大学 2013
[8]葡萄漆酶的毕赤酵母异源表达纯化及酶学特性与功能研究[D]. 林亚虬.南京农业大学 2013
[9]禽白血病病毒逆转录环介导等温扩增检测方法的研究[D]. 邢秀皎.中国兽医药品监察所 2011
[10]山东地区禽白血病发病鸡群的流行病学调查及致病特性的研究[D]. 杨凤.山东农业大学 2011
本文编号：3035921
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