猪DGAT1基因肌肉超表达转基因小鼠及克隆猪的检测验证

发布时间：2021-02-16 01:54

　　猪肉是人类摄取动物蛋白的重要来源,优质猪肉细嫩多汁、口感丰富、肉色鲜红,而肌内脂肪（Intramuscular fat, IMF）含量与其有着极高的关联,因此成为评定肉质的重要指标。人类对猪的长期遗传选育投入了很大的人力和物力,更偏重于降低背膘厚度和提高瘦肉率,然而造成了肌内脂肪含量的大幅下降,甚至高瘦肉型猪IMF含量降到了1.5%（建议范围：2.5%-3%）,导致猪肉品质下降、口感变差,因此今后的选育方向转变成在确保瘦肉率的同时增加IMF含量。研究表明,肌内脂肪含量的提高即意味着甘油三酯（triglycerol, TAG）含量的提高。DGAT1限速酶催化甘油三酯合成反应的最后一步,在哺乳动物的脂类代谢中发挥着重要作用。因此,本研究以二酰基甘油酰基转移酶1作为候选基因,构建了肌肉特异性真核表达载体sMCK-sDGAT1,通过显微注射和体细胞克隆分别获得了转基因小鼠和转基因猪,以研究肌肉超表达DGAT1的效果和影响,为今后的研究提供材料并奠定基础。取得的主要研究成果有：1、根据基因重组的原理,从猪MCK基因的细菌人工染色体中,获得了MCK基因长度为7261个碱基的启动子序列。以真核表达载... 

【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：96 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
缩略词表
第一章 文献综述
    1 前言
    2 影响脂肪代谢的基因
        2.1 影响脂肪代谢的基因
            2.1.1 乙酰辅酶A羧化酶
            2.1.2 脂肪酸合成酶
            2.1.3 脂肪酸结合蛋白
            2.1.4 脂蛋白脂酶
            2.1.5 激素敏感脂肪酶
            2.1.6 过氧化物酶体增殖蛋白激活受体γ
        2.2. DGAT1基因研究现状
            2.2.1 DGAT1基因的结构特征与生物学特征
            2.2.2 DGAT1基因的生物学功能
    3 肌肉肌酸激酶
    4 转基因技术研究进展
        4.1 原核显微注射
        4.2 精子载体介导法
        4.3 病毒介导载体法
        4.4 胚胎干细胞介导法
        4.5 体细胞克隆技术
            4.5.1 体细胞克隆技术
            4.5.2 体细胞克隆猪的应用
第二章 研究的目的和意义
第三章 材料与方法
    1 材料
        1.1 主要仪器与设备
        1.2 主要试剂及试剂盒
        1.3 常用化学试剂及其配制
            1.3.1 培养基的配制
            1.3.2 其他主要化学试剂的配制
        1.4 载体
        1.5 主要分子生物学软件及数据库
    2 试验方法
        2.1 sMCK-sDGAT1载体的构建
            2.1.1 pEGFP-N1L-MCK载体的双酶切
            2.1.2 pMD18-DGAT1载体的双酶切
            2.1.3 连接载体和基因DGAT1片段
            2.1.4 sMCK-sDGAT1载体的鉴定和线性化
            2.1.5 sMCK-sDGAT1载体的线性化和回收
        2.2 转基因小鼠制备与表达检测
            2.2.1 转基因小鼠的制备
            2.2.2 转基因小鼠F1代的制备
            2.2.3 转基因小鼠F1代DNA水平的检测
            2.2.4 转基因小鼠F1代RNA水平的检测
            2.2.5 转基因小鼠骨骼肌相关基因蛋白水平的检测
            2.2.6 转基因小鼠骨骼肌甘油三酯、脂肪酸的测定和脂肪染色
        2.3 猪胚胎成纤维转基因细胞系的建立与检测
            2.3.1 猪胚胎成纤维细胞系的建立
            2.3.2 转基因细胞系的建立与检测
        2.4 转基因猪的制备和初步分子检测
            2.4.1 转基因猪的制备
            2.4.2 转基因猪的初步分子检测
第四章 结果与分析
    1 sMCK-sDGAT1载体的构建
        1.1 pMD18-DGAT1载体的双酶切
        1.2 sMCK-sDGAT1载体的鉴定和线性化
    2 转基因小鼠的验证
        2.1 转基因小鼠gDNA的PCR检测
        2.2 转基因小鼠的Southern Blot检测
        2.3 转基因小鼠的组织表达谱
        2.4 检测DGAT1上调对骨骼肌相关基因表达的影响分析
        2.5 转基因小鼠的Western blot检测
        2.6 转基因小鼠8-18周龄体重变化
        2.7 转基因小鼠骨骼肌甘油三酯和脂肪酸的测定
        2.8 转基因小鼠骨骼肌的脂肪染色
    3 猪胚胎成纤维细胞系的建立
        3.1 建立猪胚胎成纤维细胞系
        3.2 猪30d日龄胚胎性别的鉴定
        3.3 大白猪胎儿成纤维细胞对G418敏感性的检测
        3.4 转sMCK-sDGAT1载体的细胞单克隆的筛选
        3.5 转sMCK-sDGAT1载体的细胞单克隆的分子鉴定
    4 转sMCK-sDGAT1载体克隆猪的初步鉴定
        4.1 转sMCK-sDGAT1载体克隆猪的DNA鉴定
        4.2 绝对定量PCR对外源基因拷贝数的检测
第五章 讨论
    1 对转基因动物的鉴定
    2 脂肪代谢相关基因的表达情况
        2.1 ACC1
        2.2 FABP4
        2.3 UCP1
    3 骨骼肌肌内脂肪的沉积
    4 制备转基因克隆猪
    5 对转基因克隆猪外源基因拷贝数的检测
第六章 结论
    1 主要研究成果
    2 主要创新点
    3 本研究的不足之处
    4 下一步工作计划
参考文献
附录1 载体sMCK-sDGAT1序列
附录2 转基因小鼠RT-PCR引物
在读期间发表的文章
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]大白猪二脂酰甘油酰基转移酶1和2基因（DGAT1和DGAT2）发育性表达特点及其与背膘厚的关联分析[J]. 王国富,高树新,张立凡,蔡兆伟,徐宁迎.  农业生物技术学报. 2011(04)
[2]西藏小型猪胚胎成纤维细胞的分离培养及性别鉴定[J]. 黄黎珍,那顺巴雅尔,赖良学,顾为望.  实用预防医学. 2010(10)
[3]人体腹部脂肪组织解偶联蛋白1基因表达水平的探索研究[J]. 王倩,戈小虎,李雪松,张卫国,严卫丽.  新疆医科大学学报. 2009(05)
[4]转基因动物研究进展[J]. 曹宏楷.  江西畜牧兽医杂志. 2008(02)
[5]猪生长肥育期背最长肌LPL基因表达与肌内脂肪含量相关研究[J]. 廉红霞,卢德勋,高民.  畜牧与兽医. 2007(12)
[6]转基因技术改良家畜的现状与趋势[J]. 童佳,李宁.  中国农业科技导报. 2007(04)
[7]猪体细胞克隆研究进展[J]. 张德福,吴华莉,刘东,陈学进,陈莹,王凯.  上海农业学报. 2007(03)
[8]实时荧光定量PCR法检测转基因小鼠拷贝数[J]. 王晓建,杨旭,宋晓东,张禅那,刘继斌,邸冉,张连峰,惠汝太.  中国实验动物学报. 2007(03)
[9]猪不同生长阶段脂肪酸合成酶基因的表达差异[J]. 单体中,汪以真.  农业生物技术学报. 2006(02)
[10]DGAT相关基因研究进展[J]. 马海明,施启顺,柳小春.  遗传学报. 2005(12)



本文编号：3035930