猪常见四种病毒和四种细菌TaqMan多重荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

发布时间：2021-02-23 21:01

　　猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型以及猪伪狂犬病病毒在临床诊断过程中因具有比较相似的临床症状而较难确诊,同时金黄色葡萄球菌、链球菌、沙门菌、大肠埃希菌四种致病菌时刻危胁着动物健康和公共卫生安全,而且其在病毒感染中常常继发感染,四种病毒和四种细菌中2³种混合感染的病例较为常见,因此建立一种特异、灵敏、快速及量化的检测方法,用于临床诊断和检测疾病,同时为疾病的防控和净化提供帮助都是有必要的。本研究通过对以上四种病毒和四种细菌的NCBI中登录的相应基因保守序列设计特异性的引物与TaqMan探针,建立一种可以检测以上四种病毒和四种细菌的TaqMan多重荧光定量PCR方法,并初步应用于临床实践。本研究为猪群常见疾病的诊断和实验室研究提供一种良好的荧光定量PCR方法,为疾病的防控与净化提供了一定的技术基础。本研究取得如下结果:1.通过对猪瘟病毒的E2基因、猪繁殖与呼吸综合征病毒的ORF7基因、猪圆环病毒2型的ORF1基因和猪伪狂犬病病毒的gE基因分别设计四对特异性引物和四条探针,建立能够同时检测四种病毒的多重TaqMan荧光定量PCR方法,并对其特异性、灵敏性及... 

【文章来源】：西北农林科技大学陕西省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：51 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
abstract
文献综述
    第一章 猪常见四种病毒和四种细菌及荧光定量PCR方法的研究概况
        1.1 猪常见四种病毒的研究概况
            1.1.1 猪瘟病毒
            1.1.2 猪繁殖与呼吸综合征病毒
            1.1.3 猪圆环病毒2型
            1.1.4 猪伪狂犬病病毒
        1.2 猪常见四种细菌的研究概况
            1.2.1 金黄色葡萄球菌
            1.2.2 链球菌
            1.2.3 沙门菌
            1.2.4 大肠埃希菌
        1.3 病毒检测方法的研究概况
            1.3.1 病毒的分离
            1.3.2 血清学检测技术
            1.3.3 分子生物学检测技术
        1.4 细菌检测方法的研究概况
            1.4.1 细菌的分离鉴定
            1.4.2 血清学检测技术
            1.4.3 分子生物学检测技术
        1.5 实时荧光定量PCR检测技术的研究概况
            1.5.1 实时荧光定量PCR技术的原理
            1.5.2 实时荧光定量PCR技术的分类
            1.5.3 本试验涉及病毒和细菌的荧光定量PCR方法的研究
        1.6 本研究的目的和意义
试验研究
    第二章 猪常见四种病毒TaqMan多重荧光定量PCR方法的建立及初步应用
        2.1 材料
            2.1.1 毒株,细胞株和菌株
            2.1.2 主要试剂
            2.1.3 主要设备仪器
            2.1.4 临床样本
        2.2 方法
            2.2.1 引物和探针的设计
            2.2.2 病毒RNA的提取及逆转录
            2.2.3 病毒DNA的提取
            2.2.4 目的基因的扩增
            2.2.5 PCR产物回收纯化
            2.2.6 目的片段的克隆及标准模板制备
            2.2.7 TaqMan荧光定量PCR扩增
            2.2.8 TaqMan多重实时荧光定量PCR反应条件的优化
            2.2.9 TaqMan多重实时荧光定量PCR标准曲线建立
            2.2.10 TaqMan多重实时荧光定量PCR特异性试验
            2.2.11 TaqMan多重实时荧光定量PCR灵敏性试验
            2.2.12 TaqMan多重实时荧光定量PCR重复性试验
            2.2.13 临床样本的检测
        2.3 结果
            2.3.1 阳性质粒鉴定结果
            2.3.2 标准模板的制备
            2.3.3 TaqMan多重实时荧光定量PCR反应条件的优化
            2.3.4 TaqMan多重实时荧光定量PCR标准曲线建立
            2.3.5 TaqMan多重实时荧光定量PCR特异性试验
            2.3.6 TaqMan多重实时荧光定量PCR灵敏性试验
            2.3.7 TaqMan多重实时荧光定量PCR重复性试验
            2.3.8 临床样品的检测
        2.4 讨论
        2.5 小结
    第三章 猪常见四种细菌TaqMan多重荧光定量PCR方法的建立及初步应用
        3.1 材料
            3.1.1 菌株和细胞株
            3.1.2 主要试剂
            3.1.3 主要设备仪器
            3.1.4 实验动物
        3.2 方法
            3.2.1 引物和探针的设计
            3.2.2 细菌培养及DNA的提取
            3.2.3 目的基因的扩增
            3.2.4 PCR产物回收纯化
            3.2.5 目的片段的克隆及标准模板制备
            3.2.6 TaqMan荧光定量PCR扩增
            3.2.7 TaqMan多重实时荧光定量PCR反应条件的优化
            3.2.8 TaqMan多重实时荧光定量PCR标准曲线建立
            3.2.9 TaqMan多重实时荧光定量PCR特异性试验
            3.2.10 TaqMan多重实时荧光定量PCR灵敏性试验
            3.2.11 TaqMan多重实时荧光定量PCR重复性试验
            3.2.12 细菌人工模拟病料的检测
        3.3 结果
            3.3.1 阳性质粒鉴定结果
            3.3.2 标准模板的制备
            3.3.3 TaqMan多重实时荧光定量PCR反应条件的优化
            3.3.4 TaqMan多重实时荧光定量PCR标准曲线建立
            3.3.5 TaqMan多重实时荧光定量PCR特异性试验
            3.3.6 TaqMan多重实时荧光定量PCR灵敏性试验
            3.3.7 TaqMan多重实时荧光定量PCR重复性试验
            3.3.8 细菌人工模拟病料的检测
        3.4 讨论
        3.5 小结
结论
参考文献
致谢
作者简介


【参考文献】：
期刊论文
[1]猪链球菌荧光定量PCR检测方法的建立及临床应用[J]. 雷宇平,王仲兵,杨治平,张仲萍,王治维,胡明明.  中国动物检疫. 2017(12)
[2]猪圆环病毒3型研究进展[J]. 张永宁,梅琳,张舟,唐丽杰,吴绍强.  东北农业大学学报. 2017(09)
[3]猪瘟病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用[J]. 王淑娟,刘梅芬,闫若潜,班付国,赵雪丽,马震原,王华俊,王翠,赵明军.  中国畜牧兽医. 2017(07)
[4]人畜共患之痛——猪链球菌病[J]. 杨德武,李同宽.  今日养猪业. 2017(03)
[5]猪瘟国内外流行新趋势[J]. 夏铭崎.  今日养猪业. 2017(03)
[6]猪伪狂犬病诊断技术的研究进展[J]. 杨国淋,李阳友,文心田.  饲料与畜牧. 2017(06)
[7]猪蓝耳病的研究进展[J]. 陈泽芳,赵爱莉.  畜禽业. 2017(03)
[8]水貂中大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌和不动杆菌三重荧光PCR方法的建立[J]. 王贵升,尹斐斐,田夫林,王金宝.  中国动物检疫. 2017(02)
[9]我国猪瘟的流行现状与防控措施建议[J]. 夏迎春.  当代畜禽养殖业. 2017(02)
[10]我国生猪生产现状及发展思路[J]. 左玲玲.  北方牧业. 2016(20)

博士论文
[1]以磁珠为载体的电化学免疫传感器[D]. 李芳.华中科技大学 2012

硕士论文
[1]临床分离的37株致病性葡萄球菌的鉴定与研究[D]. 朱彤绯.安徽农业大学 2016
[2]多重PCR检测肉及肉制品中四种食源性致病菌的研究[D]. 杨国兴.河北农业大学 2008



本文编号：3048223