维氏气单胞菌TH0426株cadA和cadB基因缺失株构建及其基因功能初探
发布时间：2021-03-02 05:55
维氏气单胞菌（Aeromonas veronii）作为一种人、兽及水生生物共患病原菌,在医学界和科学界得到了较为广泛的关注,通过对近年来的流行病学调查结果进行分析,发现A.veronii的毒力及其对药物的耐受能力方面呈逐年增强的趋势,这也使得越来越多的国家意识到该病原菌的危害,并将其列为水体质量检测的重要指标。目前针对A.veronii的研究大多集中在分离鉴定及药敏试验上,而对其毒力因子及致病机制方面的研究相对较少,这也在一定程度上限制了对该病原菌的研究进展,同时也使得越来越多的科研人员认识到毒力因子方面研究的重要性。本试验基于课题组前期的研究结果上,筛选获得了A.veronii强毒株TH0426中可能与其毒力相关的高表达蛋白--尸胺逆转运蛋白CadB,在对该蛋白的编码基因进行比对分析时,又发现在该菌株中存在的赖氨酸脱羧酶与该蛋白相关性较高;进而我们利用高效自杀性质粒介导的同源重组法对A.veronii TH0426中这两个蛋白的编码基因cadA和cadB进行了缺失,从而构建了A.veronii TH0426的cadA和cadB基因缺失突变株,通过对缺失株、互补株及野生株相关生物学特性...
【文章来源】：吉林农业大学吉林省
【文章页数】：77 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
cadA基因上、下游基因的扩增、连接A:TH0426基因组提取；B:cadA上游基因（UcadA）；C:cadA下游基因（DcadA）；D:
利用限制性内切酶 Xba I 和 Sac I 对构建成功的克隆载体 pEASY-UD cadA 和自杀性载体 pRE112 分别进行酶切（如图 1.2A），而后对目的片段与载体进行连接，从而构建重组自杀性载体 pRE112-UD cadA（如图 1.2 B）；以重组自杀性载体 pRE112-UD cadA 为模板，利用 P13-1/P13-2对其进行验证并测序，获得大小为2649bp 的基因片段（如图 1.2 C）；且测序结果经比对与原序列相符，表明成功构建了重组自杀性载体 pRE112-UD cadA。图 1.1 cadA 基因上、下游基因的扩增、连接A:TH0426 基因组提取；B: cadA 上游基因（U cadA）；C: cadA 下游基因（D cadA）； D:cadA 上下游基因连接（UD cadA）；E: 鉴定 pEASY-UD cadA 质粒Fig. 1.1 Amplification and connection of cadA upstream and downstream genesA:Gene of TH0426;B: cadA upstream gene（U cadA）;C: cadA downstream gene（D cadA）;D: cadA upstream and downstream genes（UD cadA）; E: PCR for pEASY-UD cadA
基因缺失突变片段整合至目标菌株的基因组中，该过程代表了第一同源重组的发生；在对菌株进行筛选时，我们发现 PCR 结果中存在两个目的片段，其中大小为 2244bp 的基因片段来源于重组自杀性载体所携带的 cadA 基因缺失突变片段另一个大小为 4377bp 的基因片段则来自细菌自身的基因组，该片段中包含了 UcadA 和 cadA ORF 基因片段，结果与预期相符（如图 1.3 A）。但二次同源重组的发生，并不意味着所有菌株均会缺失目的基因，变为缺失突变株；实则发生真正突变的菌株极少；大部分的菌株在二次同源重组发生后，均未缺失目的基因，只是随着重组自杀性载体的崩解，恢复为野生株；而通过负向选择获得的疑似菌株对其提取基因组后（如图 1.3 B），利用 P3-1/P3-2引物对其进行验证，缺失突变株只能扩增出大小为 2307bp 的基因片段，而野生株则扩增出大小为 4440bp 的基因片段，结果与预期相符（如图 1.3 C）；随后又利用 P4-1/P4-2引物对其再次进行验证，缺失株未扩增出相应的目的片段，而野生株扩增出大小为 815bp 的基因片段结果与预期相符（如图 1.3 D）；结果表明已成功构建 cadA 基因的缺失突变株△cadA。
【参考文献】：
期刊论文
[1]甲鱼源致病性维氏气单胞菌的分离鉴定及抑菌试验（英文）[J]. 朱芝秀,蒋新华,邓舜洲,王倍,李辉鸿,徐添悦. Agricultural Science & Technology. 2016(04)
[2]诺卡式菌和维氏气单胞菌并发引起太阳鱼死亡一例[J]. 雷燕. 当代水产. 2016(03)
[3]加州鲈源维氏气单胞菌的分离、鉴定及致病性[J]. 龙波,王均,贺扬,赵敏,王二龙,崔静雯,邓绿洲,刘韬,曾宇鲲,汪开毓,陈德芳. 中国兽医学报. 2016(01)
[4]团头鲂致病性维氏气单胞菌的分离鉴定及药敏试验[J]. 蔺凌云,潘晓艺,袁雪梅,姚嘉赟,徐洋,尹文林,许婷,郝贵杰,沈锦玉. 水产养殖. 2015(07)
[5]细菌生物膜检测方法改进与应用[J]. 尤理想,赵青,周敏,汪意涛,吴淑燕,李嫄渊,黄瑞. 实验技术与管理. 2015(03)
[6]CRISPR/Cas9系统介导基因组编辑的研究进展[J]. 刘志国. 畜牧兽医学报. 2014(10)
[7]腹泻患者粪便来源的气单胞菌分布及耐药性[J]. 葛樯樯,白永凤,陈晓,余斐,郑书发,陈瑜. 中国老年学杂志. 2013(21)
[8]多胺与细菌病原的致病性[J]. 张艳霏,马翠萍,谭训刚,邹玉霞. 微生物学通报. 2013(02)
[9]维氏气单胞菌研究进展[J]. 吴同垒,单晓枫,孟庆峰,郭伟生,王伟利,钱爱东. 中国兽药杂志. 2011(07)
[10]框镜鲤致病性维氏气单胞菌的分离鉴定[J]. 龚倩,高淑琴,单晓枫,郭伟生,孟庆峰,王伟利,钱爱东. 中国预防兽医学报. 2010(12)
硕士论文
[1]胸膜肺炎放线杆菌potD2基因缺失株的构建及其生物学特性研究[D]. 赵雨.四川农业大学 2016
[2]犬布鲁氏菌菌壳疫苗株的构建及实验免疫研究[D]. 钱晶.吉林农业大学 2014
[3]健康乌鳢体内两种气单胞菌的分离、鉴定及其毒力基因检测[D]. 胡天野.吉林农业大学 2013
[4]团头鲂池塘维氏气单胞菌的致病性、耐药性、基因分型及其分布研究[D]. 周光.上海海洋大学 2012
[5]嗜水气单胞菌J-1株ahyI基因缺失株的构建及特性分析[D]. 薛玉玲.南京农业大学 2012
[6]嗜水气单胞菌J-1株β溶血素基因缺失株的构建及特性分析[D]. 熊华萱.南京农业大学 2007
本文编号：3058737
【文章来源】：吉林农业大学吉林省
【文章页数】：77 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
cadA基因上、下游基因的扩增、连接A:TH0426基因组提取；B:cadA上游基因（UcadA）；C:cadA下游基因（DcadA）；D:
利用限制性内切酶 Xba I 和 Sac I 对构建成功的克隆载体 pEASY-UD cadA 和自杀性载体 pRE112 分别进行酶切（如图 1.2A），而后对目的片段与载体进行连接，从而构建重组自杀性载体 pRE112-UD cadA（如图 1.2 B）；以重组自杀性载体 pRE112-UD cadA 为模板，利用 P13-1/P13-2对其进行验证并测序，获得大小为2649bp 的基因片段（如图 1.2 C）；且测序结果经比对与原序列相符，表明成功构建了重组自杀性载体 pRE112-UD cadA。图 1.1 cadA 基因上、下游基因的扩增、连接A:TH0426 基因组提取；B: cadA 上游基因（U cadA）；C: cadA 下游基因（D cadA）； D:cadA 上下游基因连接（UD cadA）；E: 鉴定 pEASY-UD cadA 质粒Fig. 1.1 Amplification and connection of cadA upstream and downstream genesA:Gene of TH0426;B: cadA upstream gene（U cadA）;C: cadA downstream gene（D cadA）;D: cadA upstream and downstream genes（UD cadA）; E: PCR for pEASY-UD cadA
基因缺失突变片段整合至目标菌株的基因组中，该过程代表了第一同源重组的发生；在对菌株进行筛选时，我们发现 PCR 结果中存在两个目的片段，其中大小为 2244bp 的基因片段来源于重组自杀性载体所携带的 cadA 基因缺失突变片段另一个大小为 4377bp 的基因片段则来自细菌自身的基因组，该片段中包含了 UcadA 和 cadA ORF 基因片段，结果与预期相符（如图 1.3 A）。但二次同源重组的发生，并不意味着所有菌株均会缺失目的基因，变为缺失突变株；实则发生真正突变的菌株极少；大部分的菌株在二次同源重组发生后，均未缺失目的基因，只是随着重组自杀性载体的崩解，恢复为野生株；而通过负向选择获得的疑似菌株对其提取基因组后（如图 1.3 B），利用 P3-1/P3-2引物对其进行验证，缺失突变株只能扩增出大小为 2307bp 的基因片段，而野生株则扩增出大小为 4440bp 的基因片段，结果与预期相符（如图 1.3 C）；随后又利用 P4-1/P4-2引物对其再次进行验证，缺失株未扩增出相应的目的片段，而野生株扩增出大小为 815bp 的基因片段结果与预期相符（如图 1.3 D）；结果表明已成功构建 cadA 基因的缺失突变株△cadA。
【参考文献】：
期刊论文
[1]甲鱼源致病性维氏气单胞菌的分离鉴定及抑菌试验（英文）[J]. 朱芝秀,蒋新华,邓舜洲,王倍,李辉鸿,徐添悦. Agricultural Science & Technology. 2016(04)
[2]诺卡式菌和维氏气单胞菌并发引起太阳鱼死亡一例[J]. 雷燕. 当代水产. 2016(03)
[3]加州鲈源维氏气单胞菌的分离、鉴定及致病性[J]. 龙波,王均,贺扬,赵敏,王二龙,崔静雯,邓绿洲,刘韬,曾宇鲲,汪开毓,陈德芳. 中国兽医学报. 2016(01)
[4]团头鲂致病性维氏气单胞菌的分离鉴定及药敏试验[J]. 蔺凌云,潘晓艺,袁雪梅,姚嘉赟,徐洋,尹文林,许婷,郝贵杰,沈锦玉. 水产养殖. 2015(07)
[5]细菌生物膜检测方法改进与应用[J]. 尤理想,赵青,周敏,汪意涛,吴淑燕,李嫄渊,黄瑞. 实验技术与管理. 2015(03)
[6]CRISPR/Cas9系统介导基因组编辑的研究进展[J]. 刘志国. 畜牧兽医学报. 2014(10)
[7]腹泻患者粪便来源的气单胞菌分布及耐药性[J]. 葛樯樯,白永凤,陈晓,余斐,郑书发,陈瑜. 中国老年学杂志. 2013(21)
[8]多胺与细菌病原的致病性[J]. 张艳霏,马翠萍,谭训刚,邹玉霞. 微生物学通报. 2013(02)
[9]维氏气单胞菌研究进展[J]. 吴同垒,单晓枫,孟庆峰,郭伟生,王伟利,钱爱东. 中国兽药杂志. 2011(07)
[10]框镜鲤致病性维氏气单胞菌的分离鉴定[J]. 龚倩,高淑琴,单晓枫,郭伟生,孟庆峰,王伟利,钱爱东. 中国预防兽医学报. 2010(12)
硕士论文
[1]胸膜肺炎放线杆菌potD2基因缺失株的构建及其生物学特性研究[D]. 赵雨.四川农业大学 2016
[2]犬布鲁氏菌菌壳疫苗株的构建及实验免疫研究[D]. 钱晶.吉林农业大学 2014
[3]健康乌鳢体内两种气单胞菌的分离、鉴定及其毒力基因检测[D]. 胡天野.吉林农业大学 2013
[4]团头鲂池塘维氏气单胞菌的致病性、耐药性、基因分型及其分布研究[D]. 周光.上海海洋大学 2012
[5]嗜水气单胞菌J-1株ahyI基因缺失株的构建及特性分析[D]. 薛玉玲.南京农业大学 2012
[6]嗜水气单胞菌J-1株β溶血素基因缺失株的构建及特性分析[D]. 熊华萱.南京农业大学 2007
本文编号：3058737
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