调控狂犬病病毒嗜神经的宿主因子筛选

发布时间：2021-03-03 05:42

　　狂犬病（Rabies）是由狂犬病病毒感染引起的人畜共患病,临床大多表现为特异性恐风、恐水,咽肌痉挛、不可逆的脑脊髓炎等。尽管现在可以预防狂犬病,但我国狂犬病报告死亡数一直位居法定报告传染病前列。目前狂犬病没有有效的治疗方法,一旦发病,这种疾病几乎是致命的,对人的生命健康带来严重威胁。近年来对狂犬病的研究取得了一些进展,但对于狂犬病病毒感染发病机理的研究还不透彻。狂犬病病毒（Rabies Virus,RV）是一种严格的胞内寄生病毒,病毒的整个生命周期需要多种宿主蛋白的参与。因此,探索与病毒生命周期相互作用的宿主蛋白并深入理解其作用机制,将有助于我们解释病毒生命周期,为狂犬病的防治提供新的靶点,为研究高效的口服疫苗奠定基础。最近几年兴起的基于CRISPR技术高通量筛选技术几乎能够对病毒生命周期的所有方面进行系统的研究,可快速寻找参与病毒侵入、复制等生物学过程的关键宿主蛋白。所以,CRISPR/Cas9技术将会为狂犬病病毒生命周期的进一步探索,靶向药物的设计及治疗提供有力的技术支持。本研究通过使用慢病毒转导的方法在鼠神经瘤母细胞（N2a）细胞上构建表达Cas9蛋白的N2a-Cas9单克隆细胞... 

【文章来源】：中国农业科学院北京市

【文章页数】：53 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

CRISPR-Cas系统的阶段

CRISPR/Cas9的应用(STERNBERGandDOUDNA,2015)

中国农业科学院硕士学位论文第一章绪论7图1-3CRISPR-Cas9功能基因组学筛选模型及类型(SOetal.,2019)Fig.1-3CRISPR-Cas9functionalgenomicsscreenmodelandthetype(SOetal.,2019)1.3.2CRISPR/Cas9高通量筛选技术流程CRISPR作为一种新的筛选技术，阵列筛选与混合筛选是CRISPR/Cas9文库筛选常用的表现形式。阵列筛选在多孔板上操作，每孔包含一个独特的已知的sgRNA，可以检测多种细胞表型，但是这种方式需要较高的费用并且耗时长，不具有实用性，混合筛选被广泛使用中。在混合筛选中，慢病毒sgRNAs混合在一起，同时以低MOI大规模转导到靶细胞。为了减少sgRNA损失，CRISPR/Cas9功能基因筛选通过为每个sgRNA转导到平均500-1000个细胞，以保持完整的sgRNA文库覆盖率(DOENCHetal.,2016)。然后，通过利用一种生存/死亡表型或通过荧光激活细胞分选仪(florescence-activatedcellsorting,FACS)来分离带标记的细胞。由于每个sgRNA的两侧都具有相同的序列（例如，5"端的U6启动子和在3"端sgRNA的支架序列），整合到所选细胞集落的基因组


本文编号：3060724