猪MYOD/PPAR-γ2转基因鼠外源基因的插入位点效应的研究
发布时间：2021-03-17 19:49
外源基因在转基因动物体内的表达既受到表达载体的启动子影响,又受到外源基因在插入过程中所引起的插入位点效应的影响。本实验室采用原核显微注射法制备了可以稳定遗传的MyoD和PPAR-γ2转基因鼠。为了研究影响外源基因在转基因动物体内表达的因素,本试验将实验室保留的F3代的MyoD和PPAR-γ2转基因鼠经世代纯繁建系,检测转基因鼠中外源基因在DNA、RNA和蛋白水平的表达;通过热不对称交错式PCR（TAIL-PCR）法对转基因鼠中的外源基因MyoD和PPAR-γ2进行定位,确定外源基因的插入位点,再分析外源基因整合过程中产生的插入位点效应,为日后应用于生产实践奠定理论基础。主要研究结果如下:1、测定PPAR-γ2转基因鼠和野生型鼠后腿肌肉组织中的甘油三酯含量和PPAR-γ蛋白的表达情况,检测的结果表明PPAR-γ2阳性转基因鼠肌内甘油三酯的含量高于野生型鼠（p<0.05）,PPAR-γ蛋白在转基因鼠中的表达高于野生型鼠;2、用RT-qPCR法检测MyoD转基因鼠各组织中外源基因的表达量,结果表明外源基因MyoD在肌肉组织中的表达量高于其他组织,且后腿肌肉组织中MyoD蛋白的表达量My...
【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：76 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略词表
第一章 文献综述
1 引言
2 转基因动物建系
3 外源基因定位的方法及研究进展
3.1 热不对称交错式PCR法
3.2 反向PCR法
3.3 荧光原位杂交法
3.4 连接介导PCR法
4 插入位点效应的研究进展
4.1 甲基化的检测方法及研究进展
4.1.1 限制性酶切PCR
4.1.2 甲基化特异性PCR
4.1.3 变性高效液相色谱法
4.1.4 亚硫酸盐测序PCR
4.1.5 亚硫酸盐PCR-SSCP
4.2 拷贝数的检测方法及研究进展
4.2.1 绝对定量PCR法
4.2.2 Southern Blot
4.2.3 CGH芯片
4.2.4 高密度SNP芯片
4.3 其他插入位点效应及研究进展
5 研究的目的与意义
第二章 材料方法
1 试验材料
1.1 试验动物
1.2 载体和质粒
1.3 主要仪器与设备
1.4 主要试剂及试剂盒
1.5 主要溶液的配制
2 试验方法
2.1 后代阳性转基因鼠的鉴定
2.1.1 小鼠基因组DNA的提取
2.1.2 阳性鼠的鉴定
2.2 转基因鼠基因组外源基因拷贝数的鉴定
2.2.1 小鼠单拷贝基因重组质粒的检测
2.2.2 PCR扩增产物的检测
2.2.3 重组质粒的转化
2.2.4 阳性克隆的检测及测序
2.2.5 将连接目的片段的pGL3-Basic的重组质粒小量提取
2.2.6 转基因鼠基因组内拷贝数的鉴定
2.3 转基因鼠目的基因在RNA水平表达情况的验证
2.3.1 转基因鼠不同组织RNA的提取
2.3.2 RNA的反转录
2.3.3 实时荧光定量PCR分析MyoD转基因鼠不同组织中MyoD基因的表达情况
2.4 转基因鼠目的基因在蛋白水平表达情况的验证
2.4.1 转基因鼠与野生型鼠肌肉组织蛋白的提取
2.4.2 Western blot检测目的蛋白质的表达量
2.5 转基因鼠肌肉组织甘油三酯的测定
2.6 外源基因定位
2.6.1 热不对称交错式PCR
2.6.2 PCR扩增产物的检测
2.6.3 PCR产物的回收及纯化
2.6.4 胶回收产物连接T载体
2.6.5 连接产物的转化
2.6.6 阳性克隆的检测及测序
2.7 亚硫酸盐PCR-SSCP
2.7.1 外源基因CpG岛分析
2.7.2 基因组DNA亚硫酸盐处理
2.7.3 亚硫酸盐处理产物PCR扩增
2.7.4 PCR扩增产物的检测
2.7.5 PCR产物的回收及纯化
2.7.6 胶回收产物连接T载体
2.7.7 连接产物的转化
2.7.8 阳性克隆的检测及测序
2.7.9 测序结果SSCP检测
2.8 统计学分析
第三章 研究结果与分析
1 PPAR-γ2 阳性转基因鼠的检测
2 PPAR-γ2 转基因鼠中外源基因稳定遗传的判定
3 肌肉组织中外源基因PPAR-γ2 的表达情况
4 肌肉组织内甘油三酯的测定
5 TAIL-PCR定位外源基因PPAR-γ2 的结果
6 PPAR-γ2 转基因鼠中外源基因存在的插入位点效应
6.1 PPAR-γ2 转基因鼠中外源基因拷贝数的判定
6.2 PPAR-γ2 转基因鼠中外源基因其他的插入位点效应
7 MyoD阳性转基因鼠的检测
8 MyoD转基因鼠中外源基因稳定遗传的判定
9 MyoD转基因鼠中外源基因MyoD的表达情况
9.1 MyoD转基因鼠中外源基因MyoD的组织表达谱分析
9.2 肌肉组织中外源基因MyoD的表达情况
10 MyoD转基因鼠中外源基因存在的插入位点效应
10.1 MyoD转基因鼠外源基因拷贝数的判定
10.2 MyoD转基因鼠中外源基因启动子区域的CpG岛甲基化的鉴定
10.3 MyoD转基因鼠外源基因其他插入位点效应的鉴定
第五章 讨论
第六章 结论
1 本试验取得的结果
2 后期研究设想
参考文献
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]禽白血病病毒衣壳蛋白p27基因绝对定量PCR方法的建立及应用[J]. 胡海,钱琨,张丹阳,石亚运,张杰,邵红霞,金文杰,秦爱建. 中国家禽. 2015(20)
[2]荣昌猪杂交群体基因组拷贝数变异鉴定与分析[J]. 龙熙,邱小田,陈磊,王金勇,李学伟. 畜牧兽医学报. 2014(04)
[3]利用连接介导PCR检测外源基因整合位点体系的建立[J]. 刘娣,李斌,张冬杰. 东北农业大学学报. 2013(12)
[4]转外源基因（pGH）在猪染色体上整合状况[J]. 蒋亚军,吴明明,孙金海. 中国兽医学报. 2013(07)
[5]转基因克隆牛外源基因整合位点的研究[J]. 谭贝贝,苏红,胡嘉祺,吴茜红,徐大庆,巩校东,李世杰. 中国农学通报. 2012(17)
[6]如皋鸡不同时期肌肉组织生长相关基因的表达谱分析[J]. 栾德琴,常国斌,盛中伟,黄正洋,周伟,龚琳琳,陈丹艳,刘岩,王克华,窦套存,陈国宏. 畜牧兽医学报. 2012(01)
[7]DNA甲基化调节转基因动物外源基因表达的研究进展[J]. 张国梁,董焕声,张西锋,沈伟. 青岛农业大学学报(自然科学版). 2011(04)
[8]拷贝数变异及其研究进展[J]. 刘欣,王立刚,王立贤. 畜牧兽医学报. 2010(08)
[9]转基因猪中外源基因拷贝数和整合位点的研究[J]. 孔庆然,武美玲,朱江,格日乐其木格,郇延军,尹智,牟彦双,刘忠华. 生物化学与生物物理进展. 2009(12)
[10]hblf广泛表达转基因小鼠品系的建立及其组织形态学分析[J]. 王水良,贺艳,谢幼华,汪垣,厉建中,王龙,王铸钢,傅继梁. 科学通报. 2003(23)
博士论文
[1]APOBEC3B基因拷贝数变异与乙肝相关性肝细胞癌易感性[D]. 张彤雯.北京协和医学院 2012
[2]1.TIMP-1转基因小鼠纯系的建立及体内表达研究 2.TIMP-1转基因小鼠染色体FISH定位[D]. 刘庆鑫.中国人民解放军军医进修学院 2002
硕士论文
[1]利用转基因鼠模型验证猪的MYOZ1/MYF6启动子上调肌肉组织中猪的PPAR-γ2/MYOD基因的表达[D]. 马娟娟.华中农业大学 2015
[2]猪骨骼肌特异性表达基因myoz1/tnnc2启动子的克隆及功能验证[D]. 尚杨杨.华中农业大学 2013
[3]猪肌肉/肝脏特异性表达MyoD/BGL1载体构建及转基因小鼠的研究[D]. 周鹏.华中农业大学 2013
[4]五指山猪KIT基因拷贝数检测暨猪PSME1基因与免疫性状关系的研究[D]. 牛玉娜.华中农业大学 2007
本文编号：3087623
【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：76 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略词表
第一章 文献综述
1 引言
2 转基因动物建系
3 外源基因定位的方法及研究进展
3.1 热不对称交错式PCR法
3.2 反向PCR法
3.3 荧光原位杂交法
3.4 连接介导PCR法
4 插入位点效应的研究进展
4.1 甲基化的检测方法及研究进展
4.1.1 限制性酶切PCR
4.1.2 甲基化特异性PCR
4.1.3 变性高效液相色谱法
4.1.4 亚硫酸盐测序PCR
4.1.5 亚硫酸盐PCR-SSCP
4.2 拷贝数的检测方法及研究进展
4.2.1 绝对定量PCR法
4.2.2 Southern Blot
4.2.3 CGH芯片
4.2.4 高密度SNP芯片
4.3 其他插入位点效应及研究进展
5 研究的目的与意义
第二章 材料方法
1 试验材料
1.1 试验动物
1.2 载体和质粒
1.3 主要仪器与设备
1.4 主要试剂及试剂盒
1.5 主要溶液的配制
2 试验方法
2.1 后代阳性转基因鼠的鉴定
2.1.1 小鼠基因组DNA的提取
2.1.2 阳性鼠的鉴定
2.2 转基因鼠基因组外源基因拷贝数的鉴定
2.2.1 小鼠单拷贝基因重组质粒的检测
2.2.2 PCR扩增产物的检测
2.2.3 重组质粒的转化
2.2.4 阳性克隆的检测及测序
2.2.5 将连接目的片段的pGL3-Basic的重组质粒小量提取
2.2.6 转基因鼠基因组内拷贝数的鉴定
2.3 转基因鼠目的基因在RNA水平表达情况的验证
2.3.1 转基因鼠不同组织RNA的提取
2.3.2 RNA的反转录
2.3.3 实时荧光定量PCR分析MyoD转基因鼠不同组织中MyoD基因的表达情况
2.4 转基因鼠目的基因在蛋白水平表达情况的验证
2.4.1 转基因鼠与野生型鼠肌肉组织蛋白的提取
2.4.2 Western blot检测目的蛋白质的表达量
2.5 转基因鼠肌肉组织甘油三酯的测定
2.6 外源基因定位
2.6.1 热不对称交错式PCR
2.6.2 PCR扩增产物的检测
2.6.3 PCR产物的回收及纯化
2.6.4 胶回收产物连接T载体
2.6.5 连接产物的转化
2.6.6 阳性克隆的检测及测序
2.7 亚硫酸盐PCR-SSCP
2.7.1 外源基因CpG岛分析
2.7.2 基因组DNA亚硫酸盐处理
2.7.3 亚硫酸盐处理产物PCR扩增
2.7.4 PCR扩增产物的检测
2.7.5 PCR产物的回收及纯化
2.7.6 胶回收产物连接T载体
2.7.7 连接产物的转化
2.7.8 阳性克隆的检测及测序
2.7.9 测序结果SSCP检测
2.8 统计学分析
第三章 研究结果与分析
1 PPAR-γ2 阳性转基因鼠的检测
2 PPAR-γ2 转基因鼠中外源基因稳定遗传的判定
3 肌肉组织中外源基因PPAR-γ2 的表达情况
4 肌肉组织内甘油三酯的测定
5 TAIL-PCR定位外源基因PPAR-γ2 的结果
6 PPAR-γ2 转基因鼠中外源基因存在的插入位点效应
6.1 PPAR-γ2 转基因鼠中外源基因拷贝数的判定
6.2 PPAR-γ2 转基因鼠中外源基因其他的插入位点效应
7 MyoD阳性转基因鼠的检测
8 MyoD转基因鼠中外源基因稳定遗传的判定
9 MyoD转基因鼠中外源基因MyoD的表达情况
9.1 MyoD转基因鼠中外源基因MyoD的组织表达谱分析
9.2 肌肉组织中外源基因MyoD的表达情况
10 MyoD转基因鼠中外源基因存在的插入位点效应
10.1 MyoD转基因鼠外源基因拷贝数的判定
10.2 MyoD转基因鼠中外源基因启动子区域的CpG岛甲基化的鉴定
10.3 MyoD转基因鼠外源基因其他插入位点效应的鉴定
第五章 讨论
第六章 结论
1 本试验取得的结果
2 后期研究设想
参考文献
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]禽白血病病毒衣壳蛋白p27基因绝对定量PCR方法的建立及应用[J]. 胡海,钱琨,张丹阳,石亚运,张杰,邵红霞,金文杰,秦爱建. 中国家禽. 2015(20)
[2]荣昌猪杂交群体基因组拷贝数变异鉴定与分析[J]. 龙熙,邱小田,陈磊,王金勇,李学伟. 畜牧兽医学报. 2014(04)
[3]利用连接介导PCR检测外源基因整合位点体系的建立[J]. 刘娣,李斌,张冬杰. 东北农业大学学报. 2013(12)
[4]转外源基因（pGH）在猪染色体上整合状况[J]. 蒋亚军,吴明明,孙金海. 中国兽医学报. 2013(07)
[5]转基因克隆牛外源基因整合位点的研究[J]. 谭贝贝,苏红,胡嘉祺,吴茜红,徐大庆,巩校东,李世杰. 中国农学通报. 2012(17)
[6]如皋鸡不同时期肌肉组织生长相关基因的表达谱分析[J]. 栾德琴,常国斌,盛中伟,黄正洋,周伟,龚琳琳,陈丹艳,刘岩,王克华,窦套存,陈国宏. 畜牧兽医学报. 2012(01)
[7]DNA甲基化调节转基因动物外源基因表达的研究进展[J]. 张国梁,董焕声,张西锋,沈伟. 青岛农业大学学报(自然科学版). 2011(04)
[8]拷贝数变异及其研究进展[J]. 刘欣,王立刚,王立贤. 畜牧兽医学报. 2010(08)
[9]转基因猪中外源基因拷贝数和整合位点的研究[J]. 孔庆然,武美玲,朱江,格日乐其木格,郇延军,尹智,牟彦双,刘忠华. 生物化学与生物物理进展. 2009(12)
[10]hblf广泛表达转基因小鼠品系的建立及其组织形态学分析[J]. 王水良,贺艳,谢幼华,汪垣,厉建中,王龙,王铸钢,傅继梁. 科学通报. 2003(23)
博士论文
[1]APOBEC3B基因拷贝数变异与乙肝相关性肝细胞癌易感性[D]. 张彤雯.北京协和医学院 2012
[2]1.TIMP-1转基因小鼠纯系的建立及体内表达研究 2.TIMP-1转基因小鼠染色体FISH定位[D]. 刘庆鑫.中国人民解放军军医进修学院 2002
硕士论文
[1]利用转基因鼠模型验证猪的MYOZ1/MYF6启动子上调肌肉组织中猪的PPAR-γ2/MYOD基因的表达[D]. 马娟娟.华中农业大学 2015
[2]猪骨骼肌特异性表达基因myoz1/tnnc2启动子的克隆及功能验证[D]. 尚杨杨.华中农业大学 2013
[3]猪肌肉/肝脏特异性表达MyoD/BGL1载体构建及转基因小鼠的研究[D]. 周鹏.华中农业大学 2013
[4]五指山猪KIT基因拷贝数检测暨猪PSME1基因与免疫性状关系的研究[D]. 牛玉娜.华中农业大学 2007
本文编号：3087623
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