单核细胞增生李斯特氏菌内化素A分段表达及主要功能区的确定
发布时间：2021-03-25 10:44
单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes, LM）是一种人畜共患的兼性细胞内寄生菌,并且是20世纪末世界卫生组织WTO列为四种最重要的食源性病原微生物之一,分布广泛,易感人群较多,可引起人类和动物的脓血症、流产、脑膜炎和胃肠炎等临床症状,同时也可以引起流产及通过胎盘引起新生儿的脓血症。其中InlA基因是LM的重要的毒力基因,InlA（内化素A）由800个氨基酸残基组成,为LM入侵人上皮细胞所必需,其受体为E-钙粘素,是最早鉴定出的与细菌侵袭相关的毒力因子,为被非吞噬细胞内化所必需,是LM所特有,不存于非致病性LM膜表面。制备针对单增李斯特菌膜表面蛋白InIA的高亲和力高特异性的抗体是建立研究LM侵入细胞时InlA各段蛋白重要性的基础。本研究通过克隆单核细胞增生李斯特氏菌特异性的膜表面蛋白InternalinA （InlA）,获得LM特异性的膜表面蛋白InlA抗体,分析其氨基酸组成和蛋白结构,经免疫家兔获得多克隆抗体,从而分段制备LM特异性的抗体。为研究与分析InlA蛋白入侵细胞时各段相关蛋白发挥的作用奠定了物质基础。利用生物软件设计单核细胞增生李斯特氏菌In...
【文章来源】：东北农业大学黑龙江省 211工程院校
【文章页数】：49 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
1 前言
1.1 LM的生物学特性
1.1.1 LM的形态结构
1.1.2 LM的生化特征
1.2 LM的毒力因子
1.2.1 LM的致病机理
1.2.2 LM的毒力因子级
1.2.3 LM表面蛋白InlA和InlB
1.2.4 InlA介导的LM内化途径（InlA/E-cad）
1.3 LM的检测方法
1.3.1 传统的分离鉴定
1.3.2 免疫学检测方法
1.3.3 分子生物学检测
1.4 研究的目的意义
2 材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 病毒株及主要实验材料
2.1.2 载体与质粒
2.1.3 实验动物
2.1.4 引物设计与合成
2.1.5 主要试剂
2.1.6 主要溶液配制
2.1.7 主要实验仪器与设备
2.2 实验方法
2.2.1 InlA基因的获得
2.2.2 重组原核表达载体的阳性重组质粒的鉴定
2.2.3 InlA分段基因在大肠杆菌中的可溶性表达
2.2.4 InlA多克隆抗体的制备
3 结果
3.1 InlA分段基因的克隆结果
3.1.1 InlA分段基因的扩增结果
3.1.2 重组质粒的鉴定结果
3.2 InlA分段基因基因重组大肠杆菌的构建
3.3 InA分段基因在大肠杆菌中的诱导表达分析
3.3.1 SDS-PAGE分析
3.3.2 可溶性表达产物的分析及诱导时间的摸索结果
3.3.3 可溶性表达产物的纯化结果
3.4 InlA分段生物活性的检测
3.4.1 表达产物的Western blot鉴定
3.4.2 天然InlA蛋白提取的Western blot鉴定
3.4.3 动物血清的Western blot鉴定
3.4.4 动物血清效价的ELISA结果
3.4.5 LM在小鼠体内定植试验结果
4 讨论
4.1 LM蛋白的分段依据
4.2 影响LM蛋白分段表达的因素
4.3 InlA主要功能区的确定
5 结论
致谢
参考文献
附录
攻读硕士学位期间发表的学术论文
【参考文献】：
期刊论文
[1]单增李斯特菌单克隆抗体的制备及胶体金试纸的研制[J]. 崔焕忠,张辉,王兴龙. 中国兽医科学. 2010(01)
[2]单增李斯特菌免疫胶体金试纸条快速检测[J]. 熊国华,于莉,曹际娟,曹远银,王静. 中国公共卫生. 2008(02)
[3]单核细胞增生性李斯特氏菌污染及其检测方法研究进展[J]. 邵俊花,葛长荣. 食品科技. 2007(01)
[4]单核细胞增多性李氏杆菌生物学特性的初步研究[J]. 杜京武,刘少宁,姜世金,孔义波. 山东科学. 2006(06)
[5]单增李斯特菌及其表面蛋白的研究进展[J]. 王海艳,刘中学,石新华,赵林立,刘虹,甄宏太. 检验检疫科学. 2006(02)
[6]产单核李斯特菌的研究进展[J]. 李郁,魏建忠,王桂军. 中国卫生检验杂志. 2005(08)
[7]应用PFGE对单核细胞增生李斯特氏菌基因分型的方法探索[J]. 王颖,陈敏,顾其芳,周培君,张美英,刘诚. 中国卫生检验杂志. 2002(05)
[8]李斯特氏菌检验方法的研究进展[J]. 马秀丽,崔言顺. 山东食品科技. 2001(01)
[9]联用VIDAS法和API Listeria法对食品中李斯特氏菌检验及分类[J]. 翁文川,覃文. 食品科学. 2000(04)
[10]PCR与微孔板杂交结合检测单核细胞增多性李斯特氏菌[J]. 姜永强,雷祚荣,李瑾,马颖. 中华微生物学和免疫学杂志. 1998(01)
博士论文
[1]单增李斯特菌ActA的表达、免疫原性及胶体金试纸研制[D]. 张辉.吉林大学 2008
本文编号：3099552
【文章来源】：东北农业大学黑龙江省 211工程院校
【文章页数】：49 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
1 前言
1.1 LM的生物学特性
1.1.1 LM的形态结构
1.1.2 LM的生化特征
1.2 LM的毒力因子
1.2.1 LM的致病机理
1.2.2 LM的毒力因子级
1.2.3 LM表面蛋白InlA和InlB
1.2.4 InlA介导的LM内化途径（InlA/E-cad）
1.3 LM的检测方法
1.3.1 传统的分离鉴定
1.3.2 免疫学检测方法
1.3.3 分子生物学检测
1.4 研究的目的意义
2 材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 病毒株及主要实验材料
2.1.2 载体与质粒
2.1.3 实验动物
2.1.4 引物设计与合成
2.1.5 主要试剂
2.1.6 主要溶液配制
2.1.7 主要实验仪器与设备
2.2 实验方法
2.2.1 InlA基因的获得
2.2.2 重组原核表达载体的阳性重组质粒的鉴定
2.2.3 InlA分段基因在大肠杆菌中的可溶性表达
2.2.4 InlA多克隆抗体的制备
3 结果
3.1 InlA分段基因的克隆结果
3.1.1 InlA分段基因的扩增结果
3.1.2 重组质粒的鉴定结果
3.2 InlA分段基因基因重组大肠杆菌的构建
3.3 InA分段基因在大肠杆菌中的诱导表达分析
3.3.1 SDS-PAGE分析
3.3.2 可溶性表达产物的分析及诱导时间的摸索结果
3.3.3 可溶性表达产物的纯化结果
3.4 InlA分段生物活性的检测
3.4.1 表达产物的Western blot鉴定
3.4.2 天然InlA蛋白提取的Western blot鉴定
3.4.3 动物血清的Western blot鉴定
3.4.4 动物血清效价的ELISA结果
3.4.5 LM在小鼠体内定植试验结果
4 讨论
4.1 LM蛋白的分段依据
4.2 影响LM蛋白分段表达的因素
4.3 InlA主要功能区的确定
5 结论
致谢
参考文献
附录
攻读硕士学位期间发表的学术论文
【参考文献】：
期刊论文
[1]单增李斯特菌单克隆抗体的制备及胶体金试纸的研制[J]. 崔焕忠,张辉,王兴龙. 中国兽医科学. 2010(01)
[2]单增李斯特菌免疫胶体金试纸条快速检测[J]. 熊国华,于莉,曹际娟,曹远银,王静. 中国公共卫生. 2008(02)
[3]单核细胞增生性李斯特氏菌污染及其检测方法研究进展[J]. 邵俊花,葛长荣. 食品科技. 2007(01)
[4]单核细胞增多性李氏杆菌生物学特性的初步研究[J]. 杜京武,刘少宁,姜世金,孔义波. 山东科学. 2006(06)
[5]单增李斯特菌及其表面蛋白的研究进展[J]. 王海艳,刘中学,石新华,赵林立,刘虹,甄宏太. 检验检疫科学. 2006(02)
[6]产单核李斯特菌的研究进展[J]. 李郁,魏建忠,王桂军. 中国卫生检验杂志. 2005(08)
[7]应用PFGE对单核细胞增生李斯特氏菌基因分型的方法探索[J]. 王颖,陈敏,顾其芳,周培君,张美英,刘诚. 中国卫生检验杂志. 2002(05)
[8]李斯特氏菌检验方法的研究进展[J]. 马秀丽,崔言顺. 山东食品科技. 2001(01)
[9]联用VIDAS法和API Listeria法对食品中李斯特氏菌检验及分类[J]. 翁文川,覃文. 食品科学. 2000(04)
[10]PCR与微孔板杂交结合检测单核细胞增多性李斯特氏菌[J]. 姜永强,雷祚荣,李瑾,马颖. 中华微生物学和免疫学杂志. 1998(01)
博士论文
[1]单增李斯特菌ActA的表达、免疫原性及胶体金试纸研制[D]. 张辉.吉林大学 2008
本文编号：3099552
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