猪肌肉组织特异性诱导表达系统的构建和检测

发布时间：2021-03-27 03:03

　　随着转基因技术的发展,获得特异性强且无生物安全隐患的高效启动子成为研究热点。本实验以蜕皮素诱导系统为介导,在实验室前期已经分离获得的具有较高调控能力兼具肌肉组织特异性表达的a-actin启动子的基础上,将蜕皮素诱导系统调节质粒中可广谱表达外源基因的CMV启动子替换为猪肌肉特异性启动子a-actiin。构建猪肌肉特异性诱导表达系统,并在细胞水平上验证该肌肉特异性诱导系统在表达外源基因时是否兼备组织特异性和可调控性,为基因治疗和外源基因在骨骼肌组织的特异性表达提供实验依据。主要研究结果如下：1.将蜕皮素诱导表达系统调节质粒pVgRXR中的CMV启动子替换为猪肌肉特异性表达的a-actin启动子,选取绿色荧光蛋白EGFP为报告基因构建诱导系统中的反应质粒pIND-EGFP,用于检测双载体表达系统是否可以成功表达外源基因。研究结果表明,本研究构建的肌肉特异性诱导表达系统可启动外源基因的表达。2.将以上系统中的EGFP报告基因替换为p-半乳糖苷酶LacZ基因用于检测该系统的表达活性。实验结果显示该诱导系统报告基因表达量在一定的范围内均与诱导时间和诱导剂量呈正比例关系,分别在诱导时间为72h和诱导... 

【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：77 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
中英文縮写对照表
第一章 文章综述
    1 前言
    2 组织特异性启动子
    3 骨骼肌特异性表达基因a-actin的研究进展
    4 蜕皮素诱导系统
    5 研究目的和意义
第二章 材料和方法
    1 实验材料
        1.1 主要仪器和设备
        1.2 所用实验试剂
        1.3 所用载体和细胞
        1.4 常用试剂的配制
            1.4.1 细胞培养所用试剂的配制
            1.4.2 β-半乳糖苷酶活性检测所需试剂的配制
        1.5 主要生物学软件
    2 实验方法
        2.1 调节质粒pVg-actin载体的构建方案
            2.1.1 载体重组的引物设计
            2.1.2 PCR产物的检测、回收及纯化
            2.1.3 PCR产物的加尾及纯化
            2.1.4 PCR产物的克隆及测序
            2.1.5 T-actin和T-ZP的小量提取及酶切回收
            2.1.6 T-actin和T-ZP的酶切鉴定及片段的回收
            2.1.7 T-ZP-actin的小量提取及酶切回收
            2.1.8 pVg-actin的小量提取及酶切鉴定
        2.2 反应质粒pIND-LacZ和pIND-MyoD载体的构建
            2.2.1 重组质粒pIND-LacZ的小量提取及酶切鉴定
            2.2.2 MyoD基因片段的扩增
            2.2.3 pVg-actin以及pIND-MyoD可用于细胞转染的质粒小量提取
        2.3 C2C12细胞系培养
            2.3.1 冻存细胞的复苏
            2.3.2 细胞的培养和传代
            2.3.3 细胞的冻存
            2.3.4 C2C12细胞的诱导分化
            2.3.5 G418筛选C2C12细胞的预实验
            2.3.6 C2C12细胞的瞬时转染
            2.3.7 C2C12细胞的稳定筛选
            2.3.8 细胞总RNA的提取
            2.3.9 细胞总蛋白浓度测定
            2.3.10 β-半乳糖苷酶活性的检测
            2.3.11 β-半乳糖苷酶标准曲线的建立
            2.3.12 数据的处理及分析
第三章 结果和分析
    1 猪肌肉特异性诱导表达系统的构建
        1.1 调节质粒pV-actin载体的构建
            1.1.1 猪α-actin启动子和ZP片段的获得
            1.1.2 T-actin及T-ZP的构建及酶切回收
            1.1.3 T-ZP-actin的构建及酶切回收
            1.1.4 pVg-actin的构建及酶切鉴定
        1.2 反应质粒pIND-EGFP/pIND-LacZ/pIND-MyoD载体的构建
            1.2.1 pIND-EGFP载体的构建和酶切鉴定
            1.2.2 pIND-LacZ载体的构建和酶切鉴定
            1.2.3 pIND-MyoD载体的构建和酶切鉴定
        1.3 C2C12细胞系的稳定筛选及诱导分化
            1.3.1 C2C12细胞的诱导分化
            1.3.2 细胞转染pVg-actin/pIND-EGFP质粒荧光检测
            1.3.3 阳性克隆细胞的检测
    2 β-半乳糖苷酶含量检测
        2.1 pVg-actin/pIND-LacZ系统中β-GaL表达量与诱导时间的关系
        2.2 pVg-actin/pIND-LacZ系统中β-GaL表达量与诱导浓度的关系
        2.3 不同时期肌管中β-GaL表达量与诱导浓度的关系
        2.4 小结
    3 pVg-actin/pIND-MyoD载体转染小鼠肌管在mRNA水平上的检测
第四章 讨论
    1 β-半乳糖苷酶报告系统的作用
    2 组织特异性启动子
    3 真核表达载体的构建
    4 稳定转染细胞系的构建
    5 MyoD基因
    6 猪肌肉特异性诱导表达系统的功能验证
第五章 结论
参考文献
附录
    附录1 α-actin启动子序列（268 bp）
    附录2 ZP上游序列（1620 bp）
    附录3 ZP-actin序列（1900 bp）
    附录4 MyoD序列（960 bp）
    附录5 EGFP序列（798bp）
致谢


【参考文献】：
期刊论文
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硕士论文
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本文编号：3102754