鸭肠炎病毒UL18基因部分特性及其原核表达蛋白应用的研究
发布时间：2021-04-17 19:03
1.鸭肠炎病毒UL18基因的序列特征与密码子使用偏爱性运用生物信息学分析软件对注册的鸭肠炎病毒（Duck enteritis virus,DEV） UL18基因（GenBank登录号为EU195093）及其编码蛋白进行了分析。结果表明,DEVUL18基因大小969bp,编码蛋白为一条含322个氨基酸残基组成的多肽,相对分子量为35.250KD,等电点理论值为8.37,无信号肽切割位点,含有15个潜在的磷酸化位点和2个N-糖基化位点,含15个潜在的B细胞表位；系统进化分析结果表明,DEVUL18属于α-疱疹病毒的一个成员,与MeHV-1的亲缘关系最近；密码子偏爱性分析结果表明,若要对DEVUL18基因进行外源表达,真核表达系统可能更容易。若选择原核表达系统,则需要对宿主表达菌进行选择和条件优化,才能有利于该基因在体外表达重组蛋白。2.鸭肠炎病毒UL18基因的原核表达、抗体制备及应用根据注册的DEV UL18基因序列,用Primer Premier6.0软件设计合成一对特异性扩增DEVUL18基因的引物。用该引物从DEV基因组中扩增UL18基因,并将其正向插入pET32a（+）原核表达质粒...
【文章来源】：四川农业大学四川省 211工程院校
【文章页数】：99 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
本论文的创新性工作
中文摘要
ABSTRACT
常用英文缩写词汇
第一部分 文献综述
第一章 疱疹病毒UL18基因及其编码蛋白的研究进展
1 疱疹病毒UL18基因序列特点
2 疱疹病毒UL18编码蛋白特点
3 UL18蛋白的作用
3.1 VP23与核衣壳的形成
3.2 VP23对衣壳关闭的作用
3.3 VP23对病毒毒力的影响
3.4 UL18蛋白限制NK细胞介导杀伤作用
4 UL18蛋白的定位
5 展望
第二部分 实验研究
第二章 鸭肠炎病毒UL18基因的序列特征及密码子偏爱性分析
摘要
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 基因文库
1.1.2 实验数据
1.1.3 主要生物信息学分析软件
1.2 方法
1.2.1 DEV UL18基因核酸序列的分子特性分析
1.2.2 DEV UL18基因编码蛋白序列的分子特性分析
1.2.3 DEV UL18基因的密码子偏爱性分析
2 结果
2.1 DEV UL18基因核酸序列的分子特征
2.2 DEV UL18基因编码蛋白序列的分子特征
2.2.1 DEV UL18基因编码蛋白的氨基酸组成分析
2.2.2 DEV UL18基因编码蛋白的结构域
2.2.3 DEV UL18基因编码蛋白的系统进化树
2.2.4 DEV UL18基因编码蛋白信号肽切割位点预测
2.2.5 DEV UL18基因编码蛋白磷酸化位点预测
2.2.6 DEV UL18基因编码蛋白糖基化位点预测
2.2.7 DEV UL18基因编码蛋白跨膜区预测
2.2.8 DEV UL18基因编码蛋白疏水性分析
2.2.9 DEV UL18基因编码蛋白抗原性分析
2.2.10 DEV UL18基因编码蛋白二级结构和三级结构预测分析
2.2.11 DEV UL18基因编码蛋白的亚细胞定位
2.3 DEV UL18基因的密码子偏爱性
2.3.1 DEV UL18基因与27种疱疹病毒UL18基因密码子使用偏爱性分析
2.3.2 DEV UL18基因密码子使用和氨基酸组成的偏爱性分析
2.3.3 DEV UL18基因密码子使用与人、酵母和大肠杆菌密码子使用偏爱性比较
3 讨论
3.1 DEV UL18基因的分子特性
3.2 DEV UL18基因编码蛋白的抗原性
3.3 DEV UL18编码蛋白与其它疱疹病毒UL18蛋白间的系统进化关系
3.4 DEV UL18基因的密码子偏爱性
4 小结
Abstract
第三章 鸭肠炎病毒UL18基因的原核表达、抗体制备及应用
摘要
1 材料
1.1 菌株、毒株和质粒
1.2 实验动物
1.3 主要试剂及其配制
1.3.1 主要试剂
1.3.2 主要试剂配制
1.4 主要仪器设备
2 方法
2.1 DEV UL18基因的克隆
2.1.1 引物设计
2.1.2 DNA的提取
2.1.3 PCR扩增DEV UL18基因
2.1.4 DEV UL18基因的PCR产物回收
2.1.5 DEV UL18基因的T-载体克隆与鉴定
2.2 DEV UL18基因原核表达质粒的构建
2.2.1 pMD18-T-UL18与表达质粒pET-32a（+）的提取、酶切与回收
2.2.2 构建重组表达菌株
2.3 DEV UL18重组蛋白的诱导表达及条件优化
2.3.1 重组表达质粒pET32a-UL18的诱导表达
2.3.2 重组质粒pET32a-UL18诱导条件优化
2.4 DEV UL18重组蛋白的纯化
2.4.1 重组表达蛋白的可溶性分析
2.4.2 重组质粒pET32a-UL18大量诱导表达
2.4.3 重组蛋白的纯化
2.4.4 重组蛋白的复性
2.4.5 Western Blotting检测
2.5 兔抗DEV UL18重组蛋白抗体的制备及纯化
2.5.1 兔抗重组蛋白高免血清的制备
2.5.2 免抗DEV UL18重组蛋白效价测定
2.5.3 兔抗重组蛋白高免血清IgG的纯化及鉴定
2.6 基于DEV UL18重组蛋白间接ELISA法检测DEV抗体的应用
2.6.1 最佳抗原包被浓度和血清稀释度的确定
2.6.2 最佳酶标二抗工作浓度的确定
2.6.3 DEV-UL18-ELISA方法临界值的确定
2.6.4 特异性试验
2.6.5 敏感性试验
2.6.6 重复性试验
2.7 基于兔抗DEV UL18重组蛋白IgG介导的免疫组化法检测DEV感染鸭组织的应用
2.7.1 组织样品的采集与处理
2.7.2 间接免疫酶组化检测DEV UL18蛋白方法的建立
2.7.3 间接免疫酶组化检测DEV UL18蛋白方法的优化
2.7.4 特异性实验
2.7.5 结果判断标准
2.7.6 基于兔抗DEV UL18重组蛋白IgG介导的免疫组化法对DEV感染鸭组织的检测
2.8 基于兔抗DEV UL18重组蛋白IgG介导的免疫荧光法检测DEV感染鸭组织的应用
2.8.1 组织样品的采集与处理
2.8.2 间接免疫荧光检测DEV UL18蛋白方法的建立
2.8.3 间接免疫荧光检测DEV感染鸭组织UL18蛋白方法的优化
2.8.4 特异性实验
2.8.5 结果判断标准
2.8.6 基于兔抗DEV UL18重组蛋白IgG介导的免疫荧光法对DEV感染鸭组织的检测
2.9 基于兔抗DEV UL18重组蛋白IgG介导的免疫荧光法检测DEV感染宿主细胞的应用
2.9.1 免疫荧光检测DEV感染宿主细胞方法的建立
2.9.2 免疫荧光检测DEV感染宿主细胞条件的优化
2.9.3 免疫荧光特异性检测
2.9.4 间接免疫荧光检测的结果判定
2.9.5 基于兔抗DEV UL18重组蛋白IgG介导的免疫荧光法对DEV感染宿主细胞的检测
3 结果
3.1 DEV UL18基因的PCR扩增结果
3.2 DEV UL18基因的T-克隆鉴定结果
3.3 原核表达质粒pET32a-UL18的构建及鉴定结果
3.4 重组质粒pET32a-UL18的诱导表达结果
3.5 重组质粒pET32a-UL18的诱导表达条件优化结果
3.5.1 表达宿主菌优化
3.5.2 温度条件优化
3.5.3 时间条件优化
3.5.4 IPTG浓度优化
3.6 重组蛋白pET32a/DEV-UL18的纯化结果
3.6.1 重组表达蛋白的可溶性分析
3.6.2 重组蛋白的大量纯化
3.7 兔抗重组蛋白pET32a/DEV-UL18抗体效价检测结果
3.8 兔抗重组蛋白pET32a/DEV-UL18抗体IgG的纯化结果
3.9 Western Blotting检测结果
3.10 基于DEV UL18重组蛋白间接ELISA法检测DEV抗体的应用
3.10.1 最佳抗原包被浓度和血清稀释度
3.10.2 最佳酶标二抗工作浓度
3.10.3 ELISA阴阳性临界值的判定标准
3.10.4 特异性试验的检测结果
3.10.5 敏感性试验的检测结果
3.10.6 重复性试验的检测结果
3.11 基于兔抗DEV UL18重组蛋白IgG介导的免疫组化的应用
3.11.1 间接免疫酶组化检测DEV感染鸭的组织切片优化结果
3.11.2 特异性试验结果
3.11.3 间接免疫酶组化法检测DEV感染鸭组织切片结果
3.12 基于兔抗DEV UL18重组蛋白IgG介导的免疫荧光检测DEV感染组织的应用
3.12.1 间接免疫荧光检测DEV感染鸭组织方法的优化
3.12.2 特异性试验
3.12.3 间接免疫荧光法检测DEV感染鸭组织的结果
3.13 基于兔抗DEV UL18重组蛋白IgG介导的免疫荧光检测DEV感染宿主细胞的应用
3.13.1 间接免疫荧光法检测DEV感染宿主细胞飞片条件优化结果
3.13.2 特异性试验
3.13.3 间接免疫荧光检测DEV感染宿主细胞飞片结果
4 讨论
4.1 DEV UL18基因的引物设计和克隆测序
4.2 DEV UL18基因的克隆测序和表达载体的选择
4.3 疱疹病毒UL18基因的表达
4.4 兔抗重组蛋白pET32a/DEV-UL18抗体IgG的制备和纯化
4.5 基于DEV UL18重组蛋白间接ELISA法检测DEV抗体方法的应用
4.6 基于兔抗DEV UL18重组蛋白抗体介导的免疫酶组化和免疫荧光法检测UL18蛋白的应用
4.6.1 免疫酶组化检测DEV UL18蛋白在组织分布方法的建立及应用
4.6.2 免疫荧光法检测DEV UL18蛋白在组织分布方法的建立及应用
4.6.3 间接免疫荧光与间接免疫酶组化检测DEV UL18蛋白在感染鸭体内分布比较
4.7 基于免抗DEV UL18重组蛋白IgG介导的免疫荧光法检测UL18蛋白细胞定位
4.7.1 关于蛋白在细胞内定位的检测方法
4.7.2 疱疹病毒DEV UL18蛋白的细胞定位与其功能的关系
5 小结
Abstract
第四章 鸭肠炎病毒UL18基因在感染宿主细胞中的转录及表达特征
摘要
1 材料
1.1 菌株、毒株和抗体
1.2 实验动物
1.3 主要试剂及其配制
1.3.1 细胞培养相关试剂
1.3.2 Western blotting检测相关试剂
1.4 主要仪器设备
2 方法
2.1 荧光定量RT-PCR检测DEV UL18基因在感染宿主细胞中的转录时相
2.1.1 荧光定量PCR引物的设计、合成及特异性检测
2.1.2 鸭胚成纤维细胞（DEF）的培养
2.1.3 DEV病毒的增值
2.1.4 总RNA的提取
2.1.5 DNA的去除
2.1.6 RNA完整性及纯度检测
2.1.7 反转录
2.1.8 目的片段的PCR扩增及回收
2.1.9 荧光定量PCR
2.1.10 荧光定量PCR标准曲线的制作
2.1.11 数据处理与分析
2.2 Western blotting检测DEV UL18在感染宿主细胞中的表达时相
2.2.1 鸭胚成纤维细胞的培养
2.2.2 DEV病毒的增殖及采样
2.2.3 SDS-PAGE电泳
2.2.4 Western blotting检测
3 结果
3.1 DEV UL18基因在感染宿主细胞中的转录时相结果
3.1.1 荧光定量PCR引物特异性检测
3.1.2 RNA完整性及纯度检测
3.1.3 荧光定量PCR标准曲线
3.1.4 DEV UL18基因在宿主细胞中的转录特征
3.2 DEV UL18基因在感染宿主细胞中的表达时相结果
4 讨论
4.1 实时荧光定量PCR检测DEV UL18基因在DEF细胞中转录时相方法的选择
4.2 DEV UL18基因的转录特征分析
4.3 DEV UL18基因的表达特征分析
5 小结
Abstract
结论
参考文献
致谢
作者简介
【参考文献】：
期刊论文
[1]鸭瘟病毒UL51基因在COS-7细胞中的瞬时表达[J]. 沈婵娟,程安春,汪铭书,郭宇飞,信洪一,徐超,贾仁勇,韩新峰. 中国兽医科学. 2009(10)
[2]鸭瘟病毒gC基因的克隆及其分子特性分析[J]. 徐超,李欣然,信洪一,练蓓,程安春,汪铭书,朱德康,贾仁勇,罗启慧,陈孝跃. 中国兽医科学. 2008(12)
[3]检测石蜡切片中鸭病毒性肠炎病毒间接原位PCR方法的建立[J]. 程安春,廖永洪,朱德康,汪铭书,罗启慧,贾仁勇,陈孝跃. 中国农业科学. 2008(12)
[4]鸭肠炎病毒UL6基因B细胞表位的预测及其主要抗原域的原核表达[J]. 孙涛,程安春,汪铭书,郭宇飞,贾仁勇,沈婵娟. 中国兽医科学. 2008(11)
[5]鸭瘟病毒dUTPase基因克隆、原核表达及在病毒感染宿主亚细胞中的定位分析[J]. 招丽婵,程安春,汪铭书,袁桂萍,贾仁勇,周登春,葛菡,孙涛,陈孝跃. 畜牧兽医学报. 2008(08)
[6]间接免疫荧光染色检测石蜡切片中的鸭病毒性肠炎病毒和抗原定位[J]. 程安春,韩晓英,朱德康,汪铭书,袁桂萍,廖永洪,徐超. 中国兽医学报. 2008(08)
[7]免疫组织化学技术在兽医诊断中的应用[J]. 万美梅,孙彦伟,林乃锋. 动物医学进展. 2008(06)
[8]伪狂犬病病毒Ea株UL18基因的克隆、序列分析及表达[J]. 薛念波,肖少波,江云波,常天明,刘曼莉,赵骞,罗锐,陈焕春,方六荣. 中国预防兽医学报. 2008(04)
[9]间接免疫荧光检测石蜡切片中鸭肿头出血症病毒及抗原定位方法的初步建立[J]. 张舍郁,程安春,汪铭书,沈婵娟,李传峰. 中国农业科学. 2008(03)
[10]Application of an indirect immunofluorescent staining method for detection of Salmonella enteritidis in paraffin slices and antigen location in infected duck tissues[J]. Bin Yan, Shu-Xuan Deng, Zhen-Hua Zhang, Nian-Chun Yin, Ping Cao, Sheng-Yan Cao, Avian Disease Research Center, Collage of Veterinary Medicine of Sichuan Agriculture University, Yaan 625014, Sichuan Province, China Ming-Shu Wang, College of Life Science and Technology of Southwest University for Nationalities, Chengdu 610041, Sichuan Province, China An-Chun Cheng, Ming-Shu Wang, Key Laboratory of Animal Disease and Human Health of Sichuan Province, College of Veterinary Medicine of Sichuan Agriculture University, Yaan 625014, Sichuan Province, China. World Journal of Gastroenterology. 2008(05)
博士论文
[1]伪狂犬病病毒上海株gE～-/gI～-/GFP～+/LacZ～+缺失株的构建及其免疫原性初步研究[D]. 姜焱.南京农业大学 2002
硕士论文
[1]鸭瘟病毒UL26.5基因的原核表达及在病毒感染细胞定位研究[D]. 张瑶.四川农业大学 2009
[2]鸭瘟强毒TK基因的原核表达及在感染鸭组织亚细胞定位研究[D]. 葛菡.四川农业大学 2008
本文编号：3143977
【文章来源】：四川农业大学四川省 211工程院校
【文章页数】：99 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
本论文的创新性工作
中文摘要
ABSTRACT
常用英文缩写词汇
第一部分 文献综述
第一章 疱疹病毒UL18基因及其编码蛋白的研究进展
1 疱疹病毒UL18基因序列特点
2 疱疹病毒UL18编码蛋白特点
3 UL18蛋白的作用
3.1 VP23与核衣壳的形成
3.2 VP23对衣壳关闭的作用
3.3 VP23对病毒毒力的影响
3.4 UL18蛋白限制NK细胞介导杀伤作用
4 UL18蛋白的定位
5 展望
第二部分 实验研究
第二章 鸭肠炎病毒UL18基因的序列特征及密码子偏爱性分析
摘要
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 基因文库
1.1.2 实验数据
1.1.3 主要生物信息学分析软件
1.2 方法
1.2.1 DEV UL18基因核酸序列的分子特性分析
1.2.2 DEV UL18基因编码蛋白序列的分子特性分析
1.2.3 DEV UL18基因的密码子偏爱性分析
2 结果
2.1 DEV UL18基因核酸序列的分子特征
2.2 DEV UL18基因编码蛋白序列的分子特征
2.2.1 DEV UL18基因编码蛋白的氨基酸组成分析
2.2.2 DEV UL18基因编码蛋白的结构域
2.2.3 DEV UL18基因编码蛋白的系统进化树
2.2.4 DEV UL18基因编码蛋白信号肽切割位点预测
2.2.5 DEV UL18基因编码蛋白磷酸化位点预测
2.2.6 DEV UL18基因编码蛋白糖基化位点预测
2.2.7 DEV UL18基因编码蛋白跨膜区预测
2.2.8 DEV UL18基因编码蛋白疏水性分析
2.2.9 DEV UL18基因编码蛋白抗原性分析
2.2.10 DEV UL18基因编码蛋白二级结构和三级结构预测分析
2.2.11 DEV UL18基因编码蛋白的亚细胞定位
2.3 DEV UL18基因的密码子偏爱性
2.3.1 DEV UL18基因与27种疱疹病毒UL18基因密码子使用偏爱性分析
2.3.2 DEV UL18基因密码子使用和氨基酸组成的偏爱性分析
2.3.3 DEV UL18基因密码子使用与人、酵母和大肠杆菌密码子使用偏爱性比较
3 讨论
3.1 DEV UL18基因的分子特性
3.2 DEV UL18基因编码蛋白的抗原性
3.3 DEV UL18编码蛋白与其它疱疹病毒UL18蛋白间的系统进化关系
3.4 DEV UL18基因的密码子偏爱性
4 小结
Abstract
第三章 鸭肠炎病毒UL18基因的原核表达、抗体制备及应用
摘要
1 材料
1.1 菌株、毒株和质粒
1.2 实验动物
1.3 主要试剂及其配制
1.3.1 主要试剂
1.3.2 主要试剂配制
1.4 主要仪器设备
2 方法
2.1 DEV UL18基因的克隆
2.1.1 引物设计
2.1.2 DNA的提取
2.1.3 PCR扩增DEV UL18基因
2.1.4 DEV UL18基因的PCR产物回收
2.1.5 DEV UL18基因的T-载体克隆与鉴定
2.2 DEV UL18基因原核表达质粒的构建
2.2.1 pMD18-T-UL18与表达质粒pET-32a（+）的提取、酶切与回收
2.2.2 构建重组表达菌株
2.3 DEV UL18重组蛋白的诱导表达及条件优化
2.3.1 重组表达质粒pET32a-UL18的诱导表达
2.3.2 重组质粒pET32a-UL18诱导条件优化
2.4 DEV UL18重组蛋白的纯化
2.4.1 重组表达蛋白的可溶性分析
2.4.2 重组质粒pET32a-UL18大量诱导表达
2.4.3 重组蛋白的纯化
2.4.4 重组蛋白的复性
2.4.5 Western Blotting检测
2.5 兔抗DEV UL18重组蛋白抗体的制备及纯化
2.5.1 兔抗重组蛋白高免血清的制备
2.5.2 免抗DEV UL18重组蛋白效价测定
2.5.3 兔抗重组蛋白高免血清IgG的纯化及鉴定
2.6 基于DEV UL18重组蛋白间接ELISA法检测DEV抗体的应用
2.6.1 最佳抗原包被浓度和血清稀释度的确定
2.6.2 最佳酶标二抗工作浓度的确定
2.6.3 DEV-UL18-ELISA方法临界值的确定
2.6.4 特异性试验
2.6.5 敏感性试验
2.6.6 重复性试验
2.7 基于兔抗DEV UL18重组蛋白IgG介导的免疫组化法检测DEV感染鸭组织的应用
2.7.1 组织样品的采集与处理
2.7.2 间接免疫酶组化检测DEV UL18蛋白方法的建立
2.7.3 间接免疫酶组化检测DEV UL18蛋白方法的优化
2.7.4 特异性实验
2.7.5 结果判断标准
2.7.6 基于兔抗DEV UL18重组蛋白IgG介导的免疫组化法对DEV感染鸭组织的检测
2.8 基于兔抗DEV UL18重组蛋白IgG介导的免疫荧光法检测DEV感染鸭组织的应用
2.8.1 组织样品的采集与处理
2.8.2 间接免疫荧光检测DEV UL18蛋白方法的建立
2.8.3 间接免疫荧光检测DEV感染鸭组织UL18蛋白方法的优化
2.8.4 特异性实验
2.8.5 结果判断标准
2.8.6 基于兔抗DEV UL18重组蛋白IgG介导的免疫荧光法对DEV感染鸭组织的检测
2.9 基于兔抗DEV UL18重组蛋白IgG介导的免疫荧光法检测DEV感染宿主细胞的应用
2.9.1 免疫荧光检测DEV感染宿主细胞方法的建立
2.9.2 免疫荧光检测DEV感染宿主细胞条件的优化
2.9.3 免疫荧光特异性检测
2.9.4 间接免疫荧光检测的结果判定
2.9.5 基于兔抗DEV UL18重组蛋白IgG介导的免疫荧光法对DEV感染宿主细胞的检测
3 结果
3.1 DEV UL18基因的PCR扩增结果
3.2 DEV UL18基因的T-克隆鉴定结果
3.3 原核表达质粒pET32a-UL18的构建及鉴定结果
3.4 重组质粒pET32a-UL18的诱导表达结果
3.5 重组质粒pET32a-UL18的诱导表达条件优化结果
3.5.1 表达宿主菌优化
3.5.2 温度条件优化
3.5.3 时间条件优化
3.5.4 IPTG浓度优化
3.6 重组蛋白pET32a/DEV-UL18的纯化结果
3.6.1 重组表达蛋白的可溶性分析
3.6.2 重组蛋白的大量纯化
3.7 兔抗重组蛋白pET32a/DEV-UL18抗体效价检测结果
3.8 兔抗重组蛋白pET32a/DEV-UL18抗体IgG的纯化结果
3.9 Western Blotting检测结果
3.10 基于DEV UL18重组蛋白间接ELISA法检测DEV抗体的应用
3.10.1 最佳抗原包被浓度和血清稀释度
3.10.2 最佳酶标二抗工作浓度
3.10.3 ELISA阴阳性临界值的判定标准
3.10.4 特异性试验的检测结果
3.10.5 敏感性试验的检测结果
3.10.6 重复性试验的检测结果
3.11 基于兔抗DEV UL18重组蛋白IgG介导的免疫组化的应用
3.11.1 间接免疫酶组化检测DEV感染鸭的组织切片优化结果
3.11.2 特异性试验结果
3.11.3 间接免疫酶组化法检测DEV感染鸭组织切片结果
3.12 基于兔抗DEV UL18重组蛋白IgG介导的免疫荧光检测DEV感染组织的应用
3.12.1 间接免疫荧光检测DEV感染鸭组织方法的优化
3.12.2 特异性试验
3.12.3 间接免疫荧光法检测DEV感染鸭组织的结果
3.13 基于兔抗DEV UL18重组蛋白IgG介导的免疫荧光检测DEV感染宿主细胞的应用
3.13.1 间接免疫荧光法检测DEV感染宿主细胞飞片条件优化结果
3.13.2 特异性试验
3.13.3 间接免疫荧光检测DEV感染宿主细胞飞片结果
4 讨论
4.1 DEV UL18基因的引物设计和克隆测序
4.2 DEV UL18基因的克隆测序和表达载体的选择
4.3 疱疹病毒UL18基因的表达
4.4 兔抗重组蛋白pET32a/DEV-UL18抗体IgG的制备和纯化
4.5 基于DEV UL18重组蛋白间接ELISA法检测DEV抗体方法的应用
4.6 基于兔抗DEV UL18重组蛋白抗体介导的免疫酶组化和免疫荧光法检测UL18蛋白的应用
4.6.1 免疫酶组化检测DEV UL18蛋白在组织分布方法的建立及应用
4.6.2 免疫荧光法检测DEV UL18蛋白在组织分布方法的建立及应用
4.6.3 间接免疫荧光与间接免疫酶组化检测DEV UL18蛋白在感染鸭体内分布比较
4.7 基于免抗DEV UL18重组蛋白IgG介导的免疫荧光法检测UL18蛋白细胞定位
4.7.1 关于蛋白在细胞内定位的检测方法
4.7.2 疱疹病毒DEV UL18蛋白的细胞定位与其功能的关系
5 小结
Abstract
第四章 鸭肠炎病毒UL18基因在感染宿主细胞中的转录及表达特征
摘要
1 材料
1.1 菌株、毒株和抗体
1.2 实验动物
1.3 主要试剂及其配制
1.3.1 细胞培养相关试剂
1.3.2 Western blotting检测相关试剂
1.4 主要仪器设备
2 方法
2.1 荧光定量RT-PCR检测DEV UL18基因在感染宿主细胞中的转录时相
2.1.1 荧光定量PCR引物的设计、合成及特异性检测
2.1.2 鸭胚成纤维细胞（DEF）的培养
2.1.3 DEV病毒的增值
2.1.4 总RNA的提取
2.1.5 DNA的去除
2.1.6 RNA完整性及纯度检测
2.1.7 反转录
2.1.8 目的片段的PCR扩增及回收
2.1.9 荧光定量PCR
2.1.10 荧光定量PCR标准曲线的制作
2.1.11 数据处理与分析
2.2 Western blotting检测DEV UL18在感染宿主细胞中的表达时相
2.2.1 鸭胚成纤维细胞的培养
2.2.2 DEV病毒的增殖及采样
2.2.3 SDS-PAGE电泳
2.2.4 Western blotting检测
3 结果
3.1 DEV UL18基因在感染宿主细胞中的转录时相结果
3.1.1 荧光定量PCR引物特异性检测
3.1.2 RNA完整性及纯度检测
3.1.3 荧光定量PCR标准曲线
3.1.4 DEV UL18基因在宿主细胞中的转录特征
3.2 DEV UL18基因在感染宿主细胞中的表达时相结果
4 讨论
4.1 实时荧光定量PCR检测DEV UL18基因在DEF细胞中转录时相方法的选择
4.2 DEV UL18基因的转录特征分析
4.3 DEV UL18基因的表达特征分析
5 小结
Abstract
结论
参考文献
致谢
作者简介
【参考文献】：
期刊论文
[1]鸭瘟病毒UL51基因在COS-7细胞中的瞬时表达[J]. 沈婵娟,程安春,汪铭书,郭宇飞,信洪一,徐超,贾仁勇,韩新峰. 中国兽医科学. 2009(10)
[2]鸭瘟病毒gC基因的克隆及其分子特性分析[J]. 徐超,李欣然,信洪一,练蓓,程安春,汪铭书,朱德康,贾仁勇,罗启慧,陈孝跃. 中国兽医科学. 2008(12)
[3]检测石蜡切片中鸭病毒性肠炎病毒间接原位PCR方法的建立[J]. 程安春,廖永洪,朱德康,汪铭书,罗启慧,贾仁勇,陈孝跃. 中国农业科学. 2008(12)
[4]鸭肠炎病毒UL6基因B细胞表位的预测及其主要抗原域的原核表达[J]. 孙涛,程安春,汪铭书,郭宇飞,贾仁勇,沈婵娟. 中国兽医科学. 2008(11)
[5]鸭瘟病毒dUTPase基因克隆、原核表达及在病毒感染宿主亚细胞中的定位分析[J]. 招丽婵,程安春,汪铭书,袁桂萍,贾仁勇,周登春,葛菡,孙涛,陈孝跃. 畜牧兽医学报. 2008(08)
[6]间接免疫荧光染色检测石蜡切片中的鸭病毒性肠炎病毒和抗原定位[J]. 程安春,韩晓英,朱德康,汪铭书,袁桂萍,廖永洪,徐超. 中国兽医学报. 2008(08)
[7]免疫组织化学技术在兽医诊断中的应用[J]. 万美梅,孙彦伟,林乃锋. 动物医学进展. 2008(06)
[8]伪狂犬病病毒Ea株UL18基因的克隆、序列分析及表达[J]. 薛念波,肖少波,江云波,常天明,刘曼莉,赵骞,罗锐,陈焕春,方六荣. 中国预防兽医学报. 2008(04)
[9]间接免疫荧光检测石蜡切片中鸭肿头出血症病毒及抗原定位方法的初步建立[J]. 张舍郁,程安春,汪铭书,沈婵娟,李传峰. 中国农业科学. 2008(03)
[10]Application of an indirect immunofluorescent staining method for detection of Salmonella enteritidis in paraffin slices and antigen location in infected duck tissues[J]. Bin Yan, Shu-Xuan Deng, Zhen-Hua Zhang, Nian-Chun Yin, Ping Cao, Sheng-Yan Cao, Avian Disease Research Center, Collage of Veterinary Medicine of Sichuan Agriculture University, Yaan 625014, Sichuan Province, China Ming-Shu Wang, College of Life Science and Technology of Southwest University for Nationalities, Chengdu 610041, Sichuan Province, China An-Chun Cheng, Ming-Shu Wang, Key Laboratory of Animal Disease and Human Health of Sichuan Province, College of Veterinary Medicine of Sichuan Agriculture University, Yaan 625014, Sichuan Province, China. World Journal of Gastroenterology. 2008(05)
博士论文
[1]伪狂犬病病毒上海株gE～-/gI～-/GFP～+/LacZ～+缺失株的构建及其免疫原性初步研究[D]. 姜焱.南京农业大学 2002
硕士论文
[1]鸭瘟病毒UL26.5基因的原核表达及在病毒感染细胞定位研究[D]. 张瑶.四川农业大学 2009
[2]鸭瘟强毒TK基因的原核表达及在感染鸭组织亚细胞定位研究[D]. 葛菡.四川农业大学 2008
本文编号：3143977
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