宿主细胞eEF1A蛋白与猪瘟病毒NS5A蛋白的相互作用及其对猪瘟病毒的抑制作用研究

发布时间：2021-04-20 05:12

　　猪瘟病毒（classical swine fever virus, CSFV）是猪瘟（classical swine fever， CSF）的病原。CSFV基因组为长约12.3kb的单股正链RNA,仅含一个大的开放阅读框架（Open reading frame,ORF）,编码一个分子量约为438kDa、具有3898个氨基酸残基的多聚蛋白。该多聚蛋白在病毒和宿主蛋白酶的水解作用下,形成4种结构蛋白和7种非结构蛋白。NS5A蛋白由497个氨基酸残基组成,在调节病毒基因组RNA的复制和蛋白质的翻译过程中发挥重要作用。为了研究与CSFV NS5A蛋白相互作用的宿主蛋白,我们构建了NS5A诱饵表达质粒和猪外周血单个核细胞表达文库,采用酵母双杂交技术筛选得到了一个与NS5A相互作用的宿主蛋白,即真核翻译延伸因子1A （eukaryotic translation elongation factor1A，eEF1A）。通过酵母共转化、GST pulldown和免疫共沉淀试验进一步对NS5A与eEF1A的相互作用进行了验证。对4种截短表达的eEF1A突变体与NS5A分别进行免疫共沉淀试验,结果表明,e... 

【文章来源】：中国农业科学院北京市

【文章页数】：49 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
图表目录
英文缩略表
第一章 引言
    1.1 猪瘟病毒概述
        1.1.1 猪瘟病毒
        1.1.2 猪瘟病毒蛋白结构及功能
    1.2 eEF1A蛋白的结构和功能
        1.2.1 eEF1复合物的结构与功能
        1.2.2 eEF1A的结构
        1.2.3 eEF1A的功能
        1.2.4 eEF1A与病毒相互作用的研究进展
    1.3 蛋白相作的研究方法
        1.3.1 离体研究方法
        1.3.2 基于细胞的研究方法
        1.3.3 基于成像的研究方法
        1.3.4 蛋白组学研究方法
        1.3.5 生物信息学研究方法
    1.4 慢病毒表达系统
    1.5 双荧光素酶报告系统
    1.6 研究的目的和意义
第二章 eEF1A蛋白与CSFV NS5A蛋白相互作用及其对猪瘟病毒的抑制作用研究
    2.1 材料和方法
        2.1.1 细胞、菌株、载体和毒株
        2.1.2 主要试剂
        2.1.3 基因扩增与克隆
        2.1.4 PBMC cDNA文库的制备
        2.1.5 酵母双杂交筛选与NS5A相互作用的蛋白
        2.1.6 eEF1A与NS5A的酵母共转化试验
        2.1.7 NS5A的原核表达及纯化
        2.1.8 细胞的转染及蛋白的真核表达
        2.1.9 GST pulldown试验
        2.1.10 免疫共沉淀试验
        2.1.11 截短表达的eEF1A与NS5A的免疫共沉淀试验
        2.1.12 上调eEF1A表达的PK-15细胞系的构建
        2.1.13 上调eEF1A的表达对CSFV增殖的影响
        2.1.14 CSFV感染对eEF1A表达的影响
        2.1.15 CSFV IRES双荧光素酶报告系统试验
        2.1.16 Western blot检测
        2.1.17 荧光定量RT-PCR
    2.2 结果
        2.2.1 酵母双杂交筛选与NS5A相互作用的宿主蛋白
        2.2.2 酵母共转化验证eEF1A与NS5A的相互作用
        2.2.3 GST pulldown验证eEF1A与NS5A的相互作用
        2.2.4 免疫共沉淀试验验证eEF1A与NS5A的相互作用
        2.2.5 eEF1A结构域I的N端是与NS5A相互作用的关键区域
        2.2.6 上调eEF1A表达抑制CSFV的增殖
        2.2.7 CSFV感染诱导eEF1A的表达上调
        2.2.8 eEF1A抑制CSFV IRES的活性
    2.3 讨论
第三章 全文结论
参考文献
致谢
作者简历



本文编号：3149043