Xist基因调控及对牛SCNT早期胚胎发育的影响

发布时间：2021-04-20 05:30

　　Xist是产生一个非编码RNA的与X染色体相关的基因,它是在合子期基因组开始激活,并且是胚胎早期发育表达的第一个印记基因。尽管Xist是在雌性动物中参与X染色体失活,但Xist RNA的功能尚未被完全认知。在动物克隆胚胎发育中许多基因表达异常,Xist也是这些异常表达基因之一。前期研究表明,利用Xist基因缺陷型供体细胞用于克隆实验,可成功将小鼠克隆效率提高8-9倍。本实验探讨了TAALE载体转染到胎牛成纤维细胞调控Xist基因表达的可行性,并且以抑制Xist基因表达的细胞作为供体制作克隆胚胎,研究Xist基因调控对牛克隆胚早期发育影响。实验结果显示,本实验设计特异性抑制Xist表达载体TALER转染雌性胎牛成纤维细胞,并用mCherry作为载体转染效率检测的报告基因。通过流式细胞仪进行分选获得阳性细胞后直接提取R.NA,反转录扩增cDNA,与同一来源细胞系进行Real time RT-PCR对Xist表达水平检测,结果发现实验组细胞Xist旧对表达量下调93.85%,说明本实验设计的载体转染系统能够有效限制Xist基因的表达。选取Xist基因抑制表达阳性的转染细胞用于体细胞核移植实验... 

【文章来源】：内蒙古大学内蒙古自治区 211工程院校

【文章页数】：50 页

【学位级别】：硕士

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摘要
ABSTRACT
目录
缩略词表
第一章 文献综述
    1.1 克隆进展
        1.1.1 哺乳动物克隆进展
        1.1.2 克隆牛进展
    1.2 X染色体失活
        1.2.1 X染色体失活机制
        1.2.2 X染色体印记失活和失活染色体的决定
        1.2.3 牛X染色体失活研究
        1.2.4 X-染色体与克隆动物
    1.3 基因表达抑制调控TALER技术简介
        1.3.1 新型基因组编辑技术TALENs
        1.3.2 TALER基因抑制调控技术工作机制
第二章 胎牛成纤维细胞转染及XIST基因抑制表达细胞的获取、筛选、鉴定
    前言
    1.1 材料
        1.1.1 实验仪器
        1.1.2 载体
        1.1.3 药品和试剂
    1.2 方法
        1.2.1 胎牛成纤维细胞解冻与培养
        1.2.2 胎牛成纤维细胞DNA提取
        1.2.3 PCR引物设计与合成
        1.2.4 胎牛成纤维细胞性别鉴定PCR与琼脂糖凝胶电泳
        1.2.5 胎牛成纤维细胞电转染
        1.2.6 转染细胞筛选
        1.2.7 细胞的冻存
        1.2.8 RNA提取与反转录
        1.2.9 Xist引物筛选
        1.2.10 转染后胎牛成纤维细胞Xist相对表达量检测
    1.3 结果
        1.3.1 胎牛成纤维细胞性别鉴定
        1.3.2 牛Xist引物筛选
        1.3.3 胎牛成纤维细胞转染、筛选
第三章 抑制供体细胞XIST基因表达对牛早期克隆胚发育的影响
    1.1 材料
        1.1.1 实验仪器
        1.1.2 药品和试剂
    1.2 方法
        1.2.1 主要试剂配制
        1.2.2 显微操作针的制备
        1.2.3 体细胞核移植
    1.3 结果
        1.3.1 体细胞核移植获得早期胚胎效率比较
        1.3.2 转染后阳性细胞做供体获得早期克隆胚胎形态
第四章 讨论
参考文献
致谢



本文编号：3149070