牛早期克隆胚胎H3K27me3修饰和转录异常的研究

发布时间：2021-04-20 09:17

　　通过体细胞核移植（somatic cell nuclear transfer,SCNT）技术,终末分化的体细胞能够被重编程至全能性状态,并最终发育成为动物个体。这一优势使得SCNT技术在动物育种、濒危动物保护、疾病模型构建、生物医药和人类治疗性克隆等方面拥有广泛的应用前景。但是,克隆胚胎往往表现出不同阶段的发育阻滞,这导致克隆动物的出生率很低;即使发育至最后,出生克隆动物也经常表现出多种发育缺陷,这些因素成为SCNT技术广泛应用的主要障碍。去分化不彻底和重编程不完全被认为是核移植重编程效率低下的主要原因之一。本课题分别针对牛早期克隆胚胎中抑制性组蛋白修饰-H3K27me3和合子基因组激活时期的转录异常展开研究,鉴定出H3K27me3是牛核移植重编程的障碍,揭示了牛克隆胚胎中存在来源于供体细胞的转录记忆,主要研究内容和结果如下:（1）通过免疫荧光染色试验,确定了牛早期SCNT胚胎中存在异常高比例的H3K27me3修饰。之后,我们试图通过抑制H3K27me3甲基转移酶-EZH2的活性、抑制EZH2的表达水平或者过表达H3K27me3去甲基化酶-KDM6A等三种方法来修正SCNT胚胎中H3K... 

【文章来源】：西北农林科技大学陕西省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：136 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第一章 动物早期胚胎发育
    1.1 脊椎动物早期卵裂
        1.1.1 快速卵裂的胚胎
        1.1.2 缓慢卵裂的胚胎
    1.2 母源-合子转换
        1.2.1 卵源性物质的降解
        1.2.2 合子基因组激活
        1.2.3 MZT的调控机制
第二章 体细胞核移植重编程
    2.1 动物体细胞核移植的研究
    2.2 核移植重编程中的分子事件
        2.2.1 供体细胞核膜破裂
        2.2.2 激活
        2.2.3 染色质重构
        2.2.4 表观修饰的擦除与重建
    2.3 重编程效率的影响因素与改进方法
        2.3.1 核移植供体细胞的选择
        2.3.2 卵母细胞的选择与去核
        2.3.3 克隆胚胎的体外培养
        2.3.4 异常组蛋白标记的修正
        2.3.5 异常DNA甲基化的修正
        2.3.6 Xist基因异常表达的修正
第三章 牛克隆胚胎中H3K27me3 的异常表达及修正
    3.1 材料和试剂
    3.2 方法
        3.2.1 原代细胞分离与培养
        3.2.2 卵母细胞的准备
        3.2.3 体外受精
        3.2.4 体细胞核移植
        3.2.5 孤雌激活
        3.2.6 显微注射
        3.2.7 细胞转染
        3.2.8 RNA提取、反转录PCR和实时荧光定量PCR
        3.2.9 免疫荧光染色
        3.2.10 蛋白免疫印迹
    3.3 结果
        3.3.1 牛附植前IVF和 SCNT胚胎中H3K27me3 表达水平的检测
        3.3.2 GSK343 处理导致牛克隆胚胎发育阻滞
        3.3.3 EZH2 基因敲降抑制牛核移植胚胎发育能力
    3.4 讨论
    3.5 小结
第四章 KDM6A过表达促进牛核移植重编程效率
    4.1 材料和试剂
    4.2 方法
        4.2.1 动物组织RNA的提取
        4.2.2 反转录PCR和实时定量PCR
        4.2.3 真核表达载体的构建
        4.2.4 体外转录
        4.2.5 显微注射
        4.2.6 亚硫酸氢盐测序
        4.2.7 RNA-seq
    4.3 结果
        4.3.1 牛KDM6A基因过表达载体的构建
        4.3.2 KDM6A促进牛核移植桑葚胚至囊胚转换
        4.3.3 转录组测序数据的质量控制
        4.3.4 转录组测序数据比对牛基因组数据
        4.3.5 组间差异表达基因的生物学进程分析
        4.3.6 KDM6A参与调节细胞粘附相关基因的表达
        4.3.7 KDM6A参与调节X染色体连锁基因和印迹基因的表达
        4.3.8 MBD3L2 敲降导致牛核移植重编程效率降低
    4.4 讨论
    4.5 小结
第五章 牛核移植重编程中体细胞记忆的研究
    5.1 材料和试剂
    5.2 方法
        5.2.1 核移植供体细胞的准备
        5.2.2 体细胞核移植
        5.2.3 孤雌激活
        5.2.4 体外受精
        5.2.5 RNA-seq
    5.3 结果
        5.3.1 转录组测序数据原始读值的分布状态
        5.3.2 转录组测序数据的比对结果
        5.3.3 BFF和 IVF8C差异表达基因的生物学进程分析
        5.3.4 IVF8C和 NT8C差异表达基因的生物学进程分析
        5.3.5 活化记忆基因与沉默记忆基因的鉴定
        5.3.6 BFF、IVF8C和 NT8C差异表达基因的生物学进程分析
        5.3.7 供体细胞、体外受精胚胎和核移植胚胎整体转录水平的分析
        5.3.8 牛核移植重编程中待选体细胞记忆基因的展示
    5.4 讨论
    5.5 小结
第六章 KDM5B通过对体细胞记忆基因的双向调控改善牛核移植重编程
    6.1 材料和试剂
    6.2 方法
        6.2.1 动物组织RNA的提取
        6.2.2 反转录PCR和实时定量PCR
        6.2.3 牛KDM5B基因过表达载体的构建
        6.2.4 体细胞核移植
        6.2.5 孤雌激活
        6.2.6 体外转录
        6.2.7 显微注射
        6.2.8 RNA-seq
    6.3 结果
        6.3.1 KDM5B真核表达载体的构建
        6.3.2 KDM5B过表达改善牛核移植重编程效率
        6.3.3 转录组测序数据的质量控制
        6.3.4 转录组测序数据的比对结果
        6.3.5 KDM5B改善牛克隆胚胎合子激活时期的转录重编程
        6.3.6 KDM5B修正牛SCNT重编程中异常的体细胞记忆
        6.3.7 特定体细胞记忆基因表达模式的展示
    6.4 讨论
    6.5 小结
全文总结
参考文献
附录
致谢
个人简介



本文编号：3149409