NJA-1菌中DON降解酶基因在毕赤酵母中的表达及其对DON降解效果分析

发布时间：2021-04-21 14:06

　　脱氧雪腐镰刀菌烯醇（Deoxynivalenol, DON）是由禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）产生的单端孢霉烯族毒素。DON是一种全球性的谷物污染物,可引起人和动物的急性中毒,造成严重的经济损失。研究资料显示,单端孢霉烯毒素的12,13环氧环是主要的致毒基团,此环一旦遭到破坏,可以大大减少毒性。环氧化物水解酶（Epoxide hydrolase, EH）在催化反应中能显示出高的对映立体选择性,水解环氧化合物生成光学活性环氧化物和相应的1,2-二醇。研究发现,瘤胃及土壤中的一些微生物可以产生环氧化物水解酶,通过分解单端孢霉烯族毒素分子中的环氧基团,从而降低毒性。本实验室从土壤中分离获得一株NJA-1菌株,可以水解DON的环氧环。研究结果显示NJA-1菌中对DON的转化起到关键作用的是环氧化物水解酶。本试验在以前试验基础上,将已获得的DON降解酶基因与真核表达载体pPIC9K重组,构建pPIC9K-EHsq真核表达载体,并转化巴斯德毕赤酵母GS115菌,进行诱导表达,利用高效液相色谱（HPLC）法研究表达产物转化DON的效果,从而证实该酶对DON具有转化作用。为该酶... 

【文章来源】：南京农业大学江苏省 211工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：75 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
目录
摘要
ABSTRACT
符号及縮略语
第一篇 文献综述
    第一章 环氧化物水解酶（EH）的研究进展
        1 EH概述
        2 EH结构与生物学功能
            2.1 EH的结构
            2.2 EH的生物功能
        3 EH的催化机制
        4 EH的应用前景
        参考文献
    第二章 巴斯德毕赤酵母表达系统的研究进展
        1 毕赤酵母概述
        2 毕赤酵母生物学特性
        3 毕赤酵母表达系统的组成
            3.1 宿主菌株
            3.2 表达载体
            3.3 表达载体的转化及与毕赤酵母的整合
        4 外源蛋白在毕赤酵母中的表达
            4.1 外源蛋白的表达方式
            4.2 表达产物的翻译后加工、修饰
        5 毕赤酵母表达系统的应用
        参考文献
第二篇 试验部分
    第三章 NJA-1菌中DON降解酶基因真核表达载体的构建及其在巴斯德毕赤酵母中的表达
        摘要
        1 材料
            1.1 菌种和质粒
            1.2 主要酶与试剂
            1.3 主要仪器设备
        2 实验方法
            2.1 原核表达载体菌pET32a（+）-EHse/BL21的活化及扩增培养
            2.2 pET32a（+）-EHse质粒的提取
            2.3 引物设计
            2.4 EH基因的PCR扩增及产物鉴定
            2.5 PCR产物的回收与纯化
            2.6 pMD-EHsq克隆载体的构建
            2.7 重组质粒pPIC9K-EHsq的构建
            2.8 重组表达载体转化毕赤酵母
            2.9 重组酵母的筛选
            2.10 pEH蛋白的诱导表达
            2.11 表达产物的SDS-PAGE电泳
        3 结果
            3.1 EH基因的PCR结果分析
            3.2 pMD-EHsq及pPIC9K大肠杆菌阳性克隆的筛选与鉴定
            3.3 重组质粒pMD-EHsq及真核载体质粒pPIC9K双酶切结果分析
            3.4 重组表达载体pPIC9K-EHsq鉴定结果分析
            3.5 转化GS115重组子的筛选和鉴定
            3.6 重组蛋白在GS115中的表达结果
        4 讨论
        参考文献
        英文摘要
    第四章 PEH蛋白转化DON效果的检测及转化条件的优化
        摘要
        1 材料
            1.1 主要试剂
            1.2 主要仪器设备
        2 方法
            2.1 pEH蛋白转化DON效果的检测（高效液相色谱法）
            2.2 pEH蛋白转化DON条件的优化
        3 结果
            3.1 DON标准曲线的绘制
            3.2 HPLC检测样品DON浓度
            3.3 初酶液对DON转化率的测定
            3.4 不同破壁方式条件下初酶液转化DON效果的比较
            3.5 不同温度条件下初酶液转化DON效果的比较
            3.6 金属离子对转化DON效果的影响
        4 讨论
        参考文献
        英文摘要
全文总结
附录
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]玉米赤霉烯酮毒素降解酶基因的克隆及在毕赤酵母中的高效表达[J]. 刘海燕,孙长坡,伍松陵,张艳菊,吴子丹.  中国粮油学报. 2011(05)
[2]微生物环氧化物水解酶的研究进展[J]. 壮晓健,金火喜,胡忠策,郑裕国.  生物技术. 2010(01)
[3]一株脱氧雪腐镰刀菌烯醇转化菌的分离、鉴定及其转化效果研究[J]. 何成华,樊彦红,刘国芳,张海彬.  南京农业大学学报. 2009(04)
[4]巴斯德毕赤酵母表达系统在动物传染病防制中应用的研究进展[J]. 孙静,孙惠玲,张培君.  中国兽医科学. 2008(05)
[5]猪γ-干扰素在毕赤酵母中的分泌表达及其抗病毒作用[J]. 姚清侠,黄勤锋,曹毅,司有辉,钱平,陈焕春.  中国兽医学报. 2008(04)
[6]毕赤酵母表达系统及其在水产领域的应用[J]. 郭小泽.  内陆水产. 2008(02)
[7]毕赤酵母FLD1启动子元件的克隆与测序[J]. Sirajo UMAR,段慧明,陈劲春.  北京化工大学学报(自然科学版). 2007(06)
[8]巴斯德毕赤酵母表达系统及其在饲料添加剂开发上的应用前景[J]. 许英蕾,孙建义,刘明启.  饲料工业. 2005(02)
[9]环氧化合物水解酶的研究进展[J]. 彭华松,宗敏华,聂凌鸿.  分子催化. 2003(01)

博士论文
[1]小麦赤霉病菌DON毒素及其降解基因Tri101的克隆和遗传转化研究[D]. 闫海霞.内蒙古农业大学 2010

硕士论文
[1]NJA-1菌中DON降解酶基因的克隆、表达及特性研究[D]. 皇超英.南京农业大学 2010
[2]环氧化物水解酶产生菌的筛选及其发酵条件和对苯基缩水甘油醚类化合物拆分条件的研究[D]. 盛艳旻.浙江工业大学 2010
[3]NJA-1菌产环氧化物水解酶条件的优化及对脱氧雪腐镰刀菌烯醇生物转化的研究[D]. 赵俊廷.南京农业大学 2008
[4]环氧化物水解酶序列识别和分类模型的构建[D]. 贾佳.浙江大学 2006



本文编号：3151898