不同启动子和插入位点表达AIV-H9 HA抗原的重组马立克氏病病毒的构建和比较研究
发布时间：2021-04-21 21:33
马立克氏病病毒（Marek’s Disease Virus, MDV） GX0101株是我们实验室在2001年从广西某鸡场中分离到一株带有禽网状内皮组织增生症病毒（REV）长末端重复序列（LTR）的1型MDV GX0101，其致病型为超强毒。将该毒株构建成细菌人工染色体（BAC）克隆，并在此传染性克隆的基础上进行了一系列的研究。其中敲除了GX0101两个致肿瘤基因Meq，构建了Meq缺失株GX0101ΔMeq，通过动物实验证明该突变株不仅失去了鸡群的致病性和免疫抑制，而且还可以对鸡群起到很好的保护性免疫作用，其保护效果要超过CVI988疫苗。本研究在GX0101ΔMeq的基础上，将该突变株作为载体表达H9N2禽流感病毒的HA基因，构建了不同的重组病毒并对这些重组病毒进行了体外和体内的研究。1抗H9N2-HA鼠多克隆抗体的制备及H9N2-HA真核表达载体的构建本研究中构建了9株以GX0101ΔMeq为载体表达H9N2-HA的重组病毒。为了验证重组病毒中HA基因在体外的表达，首先制备了H9N2禽流感HA的鼠多克隆抗体，用于后续研究中HA基因在重组MDV表达的检测。然后又构建表达H9N2-H...
【文章来源】：山东农业大学山东省
【文章页数】：141 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
符号说明
中文摘要
Abstract
1 前言
1.1 马立克氏病（MD）的研究进展
1.1.1 病原学
1.1.2 流行病学
1.1.3 感染机制及病理变化
1.1.4 诊断技术
1.1.5 致病性及疾病防制策略
1.2 MDV 分子生物学研究进展
1.2.1 MDV 基因组结构
1.2.2 MDV 结构蛋白及相关基因
1.3 禽反转录病毒与 MDV 基因重组的研究进展
1.3.1 病毒的变异
1.3.2 MDV 与 REV 间基因重组
1.3.3 MDV 与 ALV 间基因重组
1.3.4 REV 与 MDV 基因重组的机制
1.3.5 不同病毒间遗传重组流行病学意义
1.4 DNA 片段克隆的载体系统
1.4.1 质粒
1.4.2 粘粒
1.4.3 BAC 的优势及其发展
1.5 MD 的防制
1.5.1 免疫机理
1.5.2 疫苗研究进展
1.5.3 目前 MDV 疫苗的种类
1.6 禽流感研究进展
1.6.1 病毒病原学
1.6.2 禽流感的流行病学
1.6.3 禽流感的传播方式
1.7 H9N2 亚型禽流感的防制
1.7.1 全病毒灭活疫苗
1.7.2 亚单位疫苗
1.7.3 DNA 疫苗
1.7.4 表位疫苗
1.7.5 重组活载体疫苗
1.8 本研究的目的及意义
2 材料和方法
2.1 主要实验耗材和仪器
2.1.1 分子克隆相关试剂
2.1.2 常规细胞培养相关试剂
2.1.3 其他主要试剂
2.1.4 主要仪器
2.1.5 相关菌种、病毒株及载体
2.2 抗H9N2-HA鼠多克隆抗体的制备及H9N2-HA真核表达载体的构建
2.2.1 H9N2-HA 高免血清的制备
2.2.2 HA 真核表达载体的构建
2.3 一株表达 H9N2-HA 基因的重组 rGX-CMV-HA 的构建
2.3.1 原理
2.3.2 含有 HA 表达盒的外源基因与 GX0101ΔMeq 的重组
2.3.3 利用 Flp/FRT 重组系统敲出 kanr抗性筛选基因
2.3.4 大量提取重组质粒
2.3.5 重组病毒的拯救
2.3.6 rGX-CMV-HA 的生物学活性检测
2.4 重组 MDV 中不同启动子转录 H9N2-HA 基因的活性比较
2.4.1 引物设计
2.4.2 不同启动子的克隆测序
2.4.3 不同启动子转录 HA 基因真核表达质粒的构建
2.4.4 不同 HA 基因真核表达质粒的验证
2.4.5 kanr基因和 HA 基因共表达载体的构建
2.4.6 包含 kanr抗性基因和 HA 基因表达盒外源插入片段的扩增
2.4.7 HA 表达盒与 GX0101 的重组
2.4.8 重组菌内 kanr基因表达盒的敲除
2.4.9 重组病毒的拯救
2.4.10 重组病毒的验证
2.4.11 重组病毒纯度检测
2.4.12 不同重组病毒体外增殖速率的比较
2.4.13 重组病毒感染的 CEF 中 HA 蛋白量的比较
2.4.14 荧光定量
2.4.15 重组病毒在体内的复制
2.4.16 重组病毒诱导产生抗体的检测
2.4.17 攻毒保护实验
2.5 重组 MDV 载体上不同位点转录 HA 基因活性的比较
2.5.1 引物设计
2.5.2 外源插入片段的扩增以及两侧同源臂的引入
2.5.3 载体上不同位点表达 HA 基因的重组病毒的构建
2.5.4 重组病毒的拯救
2.5.5 重组病毒生物学活性的的验证
2.5.6 不同重组病毒体外增殖速率的比较
2.5.7 重组病毒感染的 CEF 中 HA 蛋白量的比较
2.5.8 荧光定量
2.5.9 重组病毒体内复制检测和抗体检测
2.5.10 攻毒保护实验
3 结果与分析
3.1 抗 H9N2-HA 鼠多价血清的制备及 H9N2-HA 真核表达载体的构建
3.1.1 HA 基因分两段克隆测序
3.1.2 HA 融合蛋白的诱导表达
3.1.3 抗 H9-HA 鼠多克隆抗体的特异性鉴定
3.1.4 H9N2-HA 基因的 RT-PCR 扩增
3.1.5 HA 真核表达载体在 CEF 细胞上的验证
3.2 一株表达 H9N2-HA 基因的重组 rGX-CMV-HA 的构建
3.2.1 与 GX0101Δmeq 重组的外源插入表达盒的 PCR 扩增与测序
3.2.2 两个表达盒与 GX0101Δmeq 之间在 EL250 中的重组
3.2.3 敲除抗性筛选基因 kanr
3.2.4 IFA 验证 HA 基因在重组 rGX-CMV-HA 中的表达
3.3 不同启动子在重组病毒中转录 H9N2-HA 活性的比较
3.3.1 不同启动子的克隆测序
3.3.2 不同启动子转录 HA 基因真核表达质粒的构建及验证
3.3.3 kanr基因和 HA 基因共表达载体的构建
3.3.4 HA 表达盒与 GX0101Δmeq 的重组
3.3.5 kanr基因表达盒的敲除
3.3.6 重组病毒中 HA 基因的表达
3.3.7 重组病毒纯度检测
3.3.8 不同重组病毒体外增殖速率的比较
3.3.9 ELISA 方法比较不同重组病毒表达 HA 蛋白的水平
3.3.10 相对 RT-PCR 荧光定量方法比较不同重组病毒转录 HA-mRNA 的水平
3.3.11 重组病毒在体内的复制
3.3.12 抗体检测
3.3.13 攻毒免疫保护试验
3.4 GX0101ΔMeq 载体中不同插入位点转录 HA 基因的活性比较
3.4.1 HA 表达盒与 GX0101ΔMeq 的重组及重组病毒的拯救
3.4.2 重组病毒的验证
3.4.3 不同重组病毒体外增殖速率的比较
3.4.4 ELISA方法比较不同重组病毒表达HA蛋白的水平
3.4.5 相对RT-PCR荧光定量方法比较不同重组病毒转录HA-mRNA的水平
3.4.6 重组病毒在体内的复制
3.4.7 抗体检测
3.4.8 攻毒免疫保护试验
4 讨论
5 结论
6 参考文献
7 致谢
8 攻读学位期间发表论文情况
【参考文献】：
期刊论文
[1]马立克氏病病毒meq基因敲除株感染性克隆的免疫效果评价[J]. 李延鹏,康孟佼,苏帅,丁家波,崔治中,朱鸿飞. 微生物学报. 2010(07)
[2]敲除meq的鸡马立克氏病毒强毒株对超强毒的免疫保护作用[J]. 苏帅,李延鹏,孙爱军,赵鹏,丁家波,朱鸿飞,崔治中. 微生物学报. 2010(03)
[3]共表达H5亚型禽流感病毒HA基因和鸡IL-2基因的重组鸡痘病毒的构建及其免疫效力研究[J]. 云水丽,张伟,刘武杰,张小荣,陈素娟,吴艳涛,彭大新,刘秀梵. 病毒学报. 2009(06)
[4]A BAC clone of MDV strain GX0101 with REV-LTR integration retained its pathogenicity[J]. LAWRENCE Petherbridge,NAIR Venugopal K. Chinese Science Bulletin. 2009(15)
[5]鸡马立克氏病病毒814株细菌人工染色体的构建[J]. 崔红玉,王云峰,石星明,童光志,兰德松,何来,仇华吉,刘长军,王玫. 生物工程学报. 2008(04)
[6]两株表达H9亚型禽流感病毒HA基因的重组鸡痘病毒的构建及其免疫效力[J]. 刘武杰,孙蕾,陈素娟,徐忠林,刘金彪,刘秀梵. 畜牧兽医学报. 2008(03)
[7]马立克氏病病毒pp38基因产物对其上游双向启动子活性的增强作用[J]. 丁家波,崔治中,姜世金,Sanjay Reddy. 中国科学（C辑:生命科学）. 2005(06)
[8]Ⅰ型马立克氏病病毒pp38和pp24基因的真核共表达[J]. 姜世金,丁家波,孟珊珊,崔治中,杨汉春. 中国病毒学. 2005(04)
[9]马立克氏病病毒pp38基因和1.8kb转录子之间双向启动子的特性研究[J]. 丁家波,崔治中,姜世金,孙爱军,孙淑红. 微生物学报. 2005(03)
[10]Isolation of recombinant field strains of Marek’s disease virus integrated with reticuloendotheliosis virus genome fragments[J]. ZHANG Zhi & CUI Zhizhong Department of Preventive Veterinary Medicine, College of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Agriculture University, Taian 271018, China. Science in China（Series C:Life Sciences）. 2005(01)
本文编号：3152529
【文章来源】：山东农业大学山东省
【文章页数】：141 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
符号说明
中文摘要
Abstract
1 前言
1.1 马立克氏病（MD）的研究进展
1.1.1 病原学
1.1.2 流行病学
1.1.3 感染机制及病理变化
1.1.4 诊断技术
1.1.5 致病性及疾病防制策略
1.2 MDV 分子生物学研究进展
1.2.1 MDV 基因组结构
1.2.2 MDV 结构蛋白及相关基因
1.3 禽反转录病毒与 MDV 基因重组的研究进展
1.3.1 病毒的变异
1.3.2 MDV 与 REV 间基因重组
1.3.3 MDV 与 ALV 间基因重组
1.3.4 REV 与 MDV 基因重组的机制
1.3.5 不同病毒间遗传重组流行病学意义
1.4 DNA 片段克隆的载体系统
1.4.1 质粒
1.4.2 粘粒
1.4.3 BAC 的优势及其发展
1.5 MD 的防制
1.5.1 免疫机理
1.5.2 疫苗研究进展
1.5.3 目前 MDV 疫苗的种类
1.6 禽流感研究进展
1.6.1 病毒病原学
1.6.2 禽流感的流行病学
1.6.3 禽流感的传播方式
1.7 H9N2 亚型禽流感的防制
1.7.1 全病毒灭活疫苗
1.7.2 亚单位疫苗
1.7.3 DNA 疫苗
1.7.4 表位疫苗
1.7.5 重组活载体疫苗
1.8 本研究的目的及意义
2 材料和方法
2.1 主要实验耗材和仪器
2.1.1 分子克隆相关试剂
2.1.2 常规细胞培养相关试剂
2.1.3 其他主要试剂
2.1.4 主要仪器
2.1.5 相关菌种、病毒株及载体
2.2 抗H9N2-HA鼠多克隆抗体的制备及H9N2-HA真核表达载体的构建
2.2.1 H9N2-HA 高免血清的制备
2.2.2 HA 真核表达载体的构建
2.3 一株表达 H9N2-HA 基因的重组 rGX-CMV-HA 的构建
2.3.1 原理
2.3.2 含有 HA 表达盒的外源基因与 GX0101ΔMeq 的重组
2.3.3 利用 Flp/FRT 重组系统敲出 kanr抗性筛选基因
2.3.4 大量提取重组质粒
2.3.5 重组病毒的拯救
2.3.6 rGX-CMV-HA 的生物学活性检测
2.4 重组 MDV 中不同启动子转录 H9N2-HA 基因的活性比较
2.4.1 引物设计
2.4.2 不同启动子的克隆测序
2.4.3 不同启动子转录 HA 基因真核表达质粒的构建
2.4.4 不同 HA 基因真核表达质粒的验证
2.4.5 kanr基因和 HA 基因共表达载体的构建
2.4.6 包含 kanr抗性基因和 HA 基因表达盒外源插入片段的扩增
2.4.7 HA 表达盒与 GX0101 的重组
2.4.8 重组菌内 kanr基因表达盒的敲除
2.4.9 重组病毒的拯救
2.4.10 重组病毒的验证
2.4.11 重组病毒纯度检测
2.4.12 不同重组病毒体外增殖速率的比较
2.4.13 重组病毒感染的 CEF 中 HA 蛋白量的比较
2.4.14 荧光定量
2.4.15 重组病毒在体内的复制
2.4.16 重组病毒诱导产生抗体的检测
2.4.17 攻毒保护实验
2.5 重组 MDV 载体上不同位点转录 HA 基因活性的比较
2.5.1 引物设计
2.5.2 外源插入片段的扩增以及两侧同源臂的引入
2.5.3 载体上不同位点表达 HA 基因的重组病毒的构建
2.5.4 重组病毒的拯救
2.5.5 重组病毒生物学活性的的验证
2.5.6 不同重组病毒体外增殖速率的比较
2.5.7 重组病毒感染的 CEF 中 HA 蛋白量的比较
2.5.8 荧光定量
2.5.9 重组病毒体内复制检测和抗体检测
2.5.10 攻毒保护实验
3 结果与分析
3.1 抗 H9N2-HA 鼠多价血清的制备及 H9N2-HA 真核表达载体的构建
3.1.1 HA 基因分两段克隆测序
3.1.2 HA 融合蛋白的诱导表达
3.1.3 抗 H9-HA 鼠多克隆抗体的特异性鉴定
3.1.4 H9N2-HA 基因的 RT-PCR 扩增
3.1.5 HA 真核表达载体在 CEF 细胞上的验证
3.2 一株表达 H9N2-HA 基因的重组 rGX-CMV-HA 的构建
3.2.1 与 GX0101Δmeq 重组的外源插入表达盒的 PCR 扩增与测序
3.2.2 两个表达盒与 GX0101Δmeq 之间在 EL250 中的重组
3.2.3 敲除抗性筛选基因 kanr
3.2.4 IFA 验证 HA 基因在重组 rGX-CMV-HA 中的表达
3.3 不同启动子在重组病毒中转录 H9N2-HA 活性的比较
3.3.1 不同启动子的克隆测序
3.3.2 不同启动子转录 HA 基因真核表达质粒的构建及验证
3.3.3 kanr基因和 HA 基因共表达载体的构建
3.3.4 HA 表达盒与 GX0101Δmeq 的重组
3.3.5 kanr基因表达盒的敲除
3.3.6 重组病毒中 HA 基因的表达
3.3.7 重组病毒纯度检测
3.3.8 不同重组病毒体外增殖速率的比较
3.3.9 ELISA 方法比较不同重组病毒表达 HA 蛋白的水平
3.3.10 相对 RT-PCR 荧光定量方法比较不同重组病毒转录 HA-mRNA 的水平
3.3.11 重组病毒在体内的复制
3.3.12 抗体检测
3.3.13 攻毒免疫保护试验
3.4 GX0101ΔMeq 载体中不同插入位点转录 HA 基因的活性比较
3.4.1 HA 表达盒与 GX0101ΔMeq 的重组及重组病毒的拯救
3.4.2 重组病毒的验证
3.4.3 不同重组病毒体外增殖速率的比较
3.4.4 ELISA方法比较不同重组病毒表达HA蛋白的水平
3.4.5 相对RT-PCR荧光定量方法比较不同重组病毒转录HA-mRNA的水平
3.4.6 重组病毒在体内的复制
3.4.7 抗体检测
3.4.8 攻毒免疫保护试验
4 讨论
5 结论
6 参考文献
7 致谢
8 攻读学位期间发表论文情况
【参考文献】：
期刊论文
[1]马立克氏病病毒meq基因敲除株感染性克隆的免疫效果评价[J]. 李延鹏,康孟佼,苏帅,丁家波,崔治中,朱鸿飞. 微生物学报. 2010(07)
[2]敲除meq的鸡马立克氏病毒强毒株对超强毒的免疫保护作用[J]. 苏帅,李延鹏,孙爱军,赵鹏,丁家波,朱鸿飞,崔治中. 微生物学报. 2010(03)
[3]共表达H5亚型禽流感病毒HA基因和鸡IL-2基因的重组鸡痘病毒的构建及其免疫效力研究[J]. 云水丽,张伟,刘武杰,张小荣,陈素娟,吴艳涛,彭大新,刘秀梵. 病毒学报. 2009(06)
[4]A BAC clone of MDV strain GX0101 with REV-LTR integration retained its pathogenicity[J]. LAWRENCE Petherbridge,NAIR Venugopal K. Chinese Science Bulletin. 2009(15)
[5]鸡马立克氏病病毒814株细菌人工染色体的构建[J]. 崔红玉,王云峰,石星明,童光志,兰德松,何来,仇华吉,刘长军,王玫. 生物工程学报. 2008(04)
[6]两株表达H9亚型禽流感病毒HA基因的重组鸡痘病毒的构建及其免疫效力[J]. 刘武杰,孙蕾,陈素娟,徐忠林,刘金彪,刘秀梵. 畜牧兽医学报. 2008(03)
[7]马立克氏病病毒pp38基因产物对其上游双向启动子活性的增强作用[J]. 丁家波,崔治中,姜世金,Sanjay Reddy. 中国科学（C辑:生命科学）. 2005(06)
[8]Ⅰ型马立克氏病病毒pp38和pp24基因的真核共表达[J]. 姜世金,丁家波,孟珊珊,崔治中,杨汉春. 中国病毒学. 2005(04)
[9]马立克氏病病毒pp38基因和1.8kb转录子之间双向启动子的特性研究[J]. 丁家波,崔治中,姜世金,孙爱军,孙淑红. 微生物学报. 2005(03)
[10]Isolation of recombinant field strains of Marek’s disease virus integrated with reticuloendotheliosis virus genome fragments[J]. ZHANG Zhi & CUI Zhizhong Department of Preventive Veterinary Medicine, College of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Agriculture University, Taian 271018, China. Science in China（Series C:Life Sciences）. 2005(01)
本文编号：3152529
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