猪δ冠状病毒N蛋白单克隆抗体制备及抗原表位的初步鉴定
发布时间：2021-04-21 23:02
猪δ冠状病毒（Porcine Deltacoronavirus,PDCo V）是一种新兴冠状病毒,可引发仔猪的呕吐、腹泻、脱水,甚至死亡,给养猪业造成巨大损失。PDCo V主要编码的4个结构蛋白是:纤突蛋白（spike,S）、核衣壳蛋白（nucleocapsid,N）、膜糖蛋白（membrane,M）、小膜蛋白（envelope,E）。其中,N蛋白在病毒RNA复制和产生过程中起重要作用,表达量大、保守性强,常作为其他冠状病毒检测病毒抗体的诊断抗原。决定抗原特异性的分子基础是抗原表位,通过对其进行研究,有利于进一步设计兼具有免疫活性和中和活性的多肽、新型诊断试剂和新型疫苗分子。鉴于此,本研究通过制备PDCo V N蛋白单克隆抗体并对抗原表位进行筛选与鉴定,为PDCo V诊断方法和新型疫苗的研究奠定基础。为了获取PDCo V N基因重组蛋白,本试验分别构建了PDCo V NH毒株的N基因的p ET-32a和p GEX-6p-1原核表达载体,并分别转化到大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中,利用浓度为1 m M的IPTG对重组菌进行诱导表达,进一步对表达的PDCo V重组N蛋白进行纯化与鉴...
【文章来源】：黑龙江八一农垦大学黑龙江省
【文章页数】：65 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
1 文献综述
1.1 PDCoV概述
1.1.1 病原学
1.1.2 基因组结构
1.1.3 结构蛋白及功能
1.1.4 PDCoV的流行病学
1.1.5 冠状病毒跨种属传播的机制
1.1.6 PDCoV的病毒分离及体外培养特性
1.1.7 PDCoV的致病性及临床症状
1.1.8 PDCoV的诊断与检测技术
1.1.9 疾病的防治
1.2 研究目的与意义
2 猪δ冠状病毒重组N蛋白的制备与抗原性检测
2.1 材料
2.1.1 主要试剂、毒株及菌种
2.1.2 主要仪器设备
2.2 方法
2.2.1 RNA提取
2.2.2 采用RT-PCR方法将目的基因片段扩增
2.2.3 PCR产物的胶回收
2.2.4 PCR产物与原核表达载体的双酶切
2.2.5 产物的连接及转化
2.2.6 鉴定重组质粒并表达蛋白
2.2.7 PDCoVN蛋白的纯化
2.2.8 PDCoV重组N蛋白的抗原性分析
2.3 结果
2.3.1 PDCoVN基因的扩增
2.3.2 重组质粒的酶切鉴定结果
2.3.3 表达重组蛋白并纯化、鉴定
2.3.4 重组N蛋白的Westernblot分析
2.4 讨论
3 猪δ冠状病毒N蛋白单克隆抗体制备及鉴定
3.1 材料
3.1.1 主要试剂、细胞及实验动物
3.1.2 主要实验仪器及设备
3.2 方法
3.2.1 单克隆抗体的制备
3.2.2 单克隆抗体的鉴定
3.3 结果
3.3.1 间接ELISA检测方法的建立
3.3.2 杂交瘤细胞株的建立
3.3.3 单克隆抗体的效价测定
3.3.4 抗体亚类的鉴定
3.3.5 单抗免疫活性及特异性鉴定结果
3.3.6 IFA试验结果
3.4 讨论
4 猪δ冠状病毒N蛋白抗原表位的鉴定
4.1 材料
4.1.1 主要试剂、毒株及菌种
4.1.2 主要实验仪器及设备
4.2 方法
4.2.1 N蛋白抗原表位的初步鉴定
4.3 结果
4.3.1 N蛋白分段扩增、克隆与表达
4.3.2 1E10株针对抗原表位的初步鉴定
4.4 讨论
5 结论
参考文献
致谢
个人简历
【参考文献】：
期刊论文
[1]规模化猪场哺乳仔猪舍和保育舍温度、湿度、有害气体测定与分析[J]. 宋志芳,芦春莲,曹洪战,苗玉涛,张力圈,白会霞. 黑龙江畜牧兽医. 2017(21)
[2]凉山地区猪腹泻样本中PEDV、PDCoV和GARV感染检测[J]. 彭艳伶,李昊,余琼,李建,张斌,沈思思,任玉鹏. 四川畜牧兽医. 2017(07)
[3]猪Delta冠状病毒和猪流行性腹泻病毒双重RT-PCR诊断方法的建立及初步应用[J]. 韩丽,周雍,李炳晓,曹贝贝,梁青青,张利卫,胡慧. 中国兽医科学. 2017(05)
[4]猪流行性腹泻病毒野毒株及弱毒疫苗株RT-PCR鉴别检测方法的建立及应用[J]. 卢冰霞,秦毅斌,段群棚,何颖,李斌,梁家幸,苏乾莲,周英宁,蒋冬福,卢敬专,陈忠伟,闭炳芬,赵武. 畜牧与兽医. 2017(02)
[5]猪德尔塔冠状病毒病的综合防治措施[J]. 张永香,陈海南. 兽医导刊. 2017(01)
[6]新发PDCoV和TGEV双重RT-PCR检测方法的建立及初步应用[J]. 刘玲玲,曹贝贝,张利卫,韩丽,韦学雷,兰培英,胡慧,王亚宾. 农业生物技术学报. 2016(12)
[7]蝙蝠携带重要人兽共患病毒研究进展[J]. 谭伟龙,王依,杨露,艾乐乐,朱长强,胡丹,王长军,邓小昭. 寄生虫与医学昆虫学报. 2016 (03)
[8]规模化猪场免疫程序调整前后抗体变化及分析[J]. 徐丹,张迪,吴婷婷,徐秀彬. 国外畜牧学(猪与禽). 2016(08)
[9]新发现的冠状病毒属——丁型冠状病毒[J]. 王逸雯,黄耀伟. 生命的化学. 2016(04)
[10]同时检测PEDV和TGEV及PDCoV的多重RT-PCR方法的建立及初步应用[J]. 任玉鹏,张斌,汤承,曹恭貌,岳华. 中国兽医科学. 2016(06)
博士论文
[1]啮齿动物中冠状病毒的分子流行病学研究及登革病毒在非疫区的再现[D]. 王文.中国疾病预防控制中心 2017
[2]基于抗原抗体立体结构的功能表位研究[D]. 魏化伟.中国人民解放军军事医学科学院 2011
[3]新发感染性疾病的未知病毒性病原体检测及鉴定技术的建立[D]. 于庭.吉林大学 2010
[4]SARS CoV动物溯源及其结构蛋白免疫学特性的研究[D]. 白冰珂.中国科学院研究生院（武汉病毒研究所） 2007
[5]SARS和SARS样冠状病毒遗传进化及其受体研究[D]. 任武泽.中国科学院研究生院（武汉病毒研究所） 2007
[6]猪瘟病毒RNA依赖的RNA聚合酶起始基因组RNA复制的分子机制研究[D]. 伊光辉.武汉大学 2004
硕士论文
[1]猪δ冠状病毒E和S1蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备[D]. 舒静超.河南农业大学 2016
[2]牛病毒性腹泻病毒p80蛋白单抗制备与表位鉴定及LJ36/14毒株的分离鉴定[D]. 杨立新.中国农业科学院 2016
[3]猪流行性腹泻病毒N蛋白基因的遗传变异及其原核表达[D]. 彭滔.四川农业大学 2013
[4]猪流行性腹泻病毒核衣壳蛋白亚细胞定位信号的鉴定[D]. 石达.中国农业科学院 2012
[5]应用噬菌体展示技术筛选抗猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体的模拟表位[D]. 王万利.中国农业科学院 2009
[6]抗猪轮状病毒VP6单克隆抗体的制备与鉴定[D]. 边亚娟.东北农业大学 2005
本文编号：3152656
【文章来源】：黑龙江八一农垦大学黑龙江省
【文章页数】：65 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
1 文献综述
1.1 PDCoV概述
1.1.1 病原学
1.1.2 基因组结构
1.1.3 结构蛋白及功能
1.1.4 PDCoV的流行病学
1.1.5 冠状病毒跨种属传播的机制
1.1.6 PDCoV的病毒分离及体外培养特性
1.1.7 PDCoV的致病性及临床症状
1.1.8 PDCoV的诊断与检测技术
1.1.9 疾病的防治
1.2 研究目的与意义
2 猪δ冠状病毒重组N蛋白的制备与抗原性检测
2.1 材料
2.1.1 主要试剂、毒株及菌种
2.1.2 主要仪器设备
2.2 方法
2.2.1 RNA提取
2.2.2 采用RT-PCR方法将目的基因片段扩增
2.2.3 PCR产物的胶回收
2.2.4 PCR产物与原核表达载体的双酶切
2.2.5 产物的连接及转化
2.2.6 鉴定重组质粒并表达蛋白
2.2.7 PDCoVN蛋白的纯化
2.2.8 PDCoV重组N蛋白的抗原性分析
2.3 结果
2.3.1 PDCoVN基因的扩增
2.3.2 重组质粒的酶切鉴定结果
2.3.3 表达重组蛋白并纯化、鉴定
2.3.4 重组N蛋白的Westernblot分析
2.4 讨论
3 猪δ冠状病毒N蛋白单克隆抗体制备及鉴定
3.1 材料
3.1.1 主要试剂、细胞及实验动物
3.1.2 主要实验仪器及设备
3.2 方法
3.2.1 单克隆抗体的制备
3.2.2 单克隆抗体的鉴定
3.3 结果
3.3.1 间接ELISA检测方法的建立
3.3.2 杂交瘤细胞株的建立
3.3.3 单克隆抗体的效价测定
3.3.4 抗体亚类的鉴定
3.3.5 单抗免疫活性及特异性鉴定结果
3.3.6 IFA试验结果
3.4 讨论
4 猪δ冠状病毒N蛋白抗原表位的鉴定
4.1 材料
4.1.1 主要试剂、毒株及菌种
4.1.2 主要实验仪器及设备
4.2 方法
4.2.1 N蛋白抗原表位的初步鉴定
4.3 结果
4.3.1 N蛋白分段扩增、克隆与表达
4.3.2 1E10株针对抗原表位的初步鉴定
4.4 讨论
5 结论
参考文献
致谢
个人简历
【参考文献】：
期刊论文
[1]规模化猪场哺乳仔猪舍和保育舍温度、湿度、有害气体测定与分析[J]. 宋志芳,芦春莲,曹洪战,苗玉涛,张力圈,白会霞. 黑龙江畜牧兽医. 2017(21)
[2]凉山地区猪腹泻样本中PEDV、PDCoV和GARV感染检测[J]. 彭艳伶,李昊,余琼,李建,张斌,沈思思,任玉鹏. 四川畜牧兽医. 2017(07)
[3]猪Delta冠状病毒和猪流行性腹泻病毒双重RT-PCR诊断方法的建立及初步应用[J]. 韩丽,周雍,李炳晓,曹贝贝,梁青青,张利卫,胡慧. 中国兽医科学. 2017(05)
[4]猪流行性腹泻病毒野毒株及弱毒疫苗株RT-PCR鉴别检测方法的建立及应用[J]. 卢冰霞,秦毅斌,段群棚,何颖,李斌,梁家幸,苏乾莲,周英宁,蒋冬福,卢敬专,陈忠伟,闭炳芬,赵武. 畜牧与兽医. 2017(02)
[5]猪德尔塔冠状病毒病的综合防治措施[J]. 张永香,陈海南. 兽医导刊. 2017(01)
[6]新发PDCoV和TGEV双重RT-PCR检测方法的建立及初步应用[J]. 刘玲玲,曹贝贝,张利卫,韩丽,韦学雷,兰培英,胡慧,王亚宾. 农业生物技术学报. 2016(12)
[7]蝙蝠携带重要人兽共患病毒研究进展[J]. 谭伟龙,王依,杨露,艾乐乐,朱长强,胡丹,王长军,邓小昭. 寄生虫与医学昆虫学报. 2016 (03)
[8]规模化猪场免疫程序调整前后抗体变化及分析[J]. 徐丹,张迪,吴婷婷,徐秀彬. 国外畜牧学(猪与禽). 2016(08)
[9]新发现的冠状病毒属——丁型冠状病毒[J]. 王逸雯,黄耀伟. 生命的化学. 2016(04)
[10]同时检测PEDV和TGEV及PDCoV的多重RT-PCR方法的建立及初步应用[J]. 任玉鹏,张斌,汤承,曹恭貌,岳华. 中国兽医科学. 2016(06)
博士论文
[1]啮齿动物中冠状病毒的分子流行病学研究及登革病毒在非疫区的再现[D]. 王文.中国疾病预防控制中心 2017
[2]基于抗原抗体立体结构的功能表位研究[D]. 魏化伟.中国人民解放军军事医学科学院 2011
[3]新发感染性疾病的未知病毒性病原体检测及鉴定技术的建立[D]. 于庭.吉林大学 2010
[4]SARS CoV动物溯源及其结构蛋白免疫学特性的研究[D]. 白冰珂.中国科学院研究生院（武汉病毒研究所） 2007
[5]SARS和SARS样冠状病毒遗传进化及其受体研究[D]. 任武泽.中国科学院研究生院（武汉病毒研究所） 2007
[6]猪瘟病毒RNA依赖的RNA聚合酶起始基因组RNA复制的分子机制研究[D]. 伊光辉.武汉大学 2004
硕士论文
[1]猪δ冠状病毒E和S1蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备[D]. 舒静超.河南农业大学 2016
[2]牛病毒性腹泻病毒p80蛋白单抗制备与表位鉴定及LJ36/14毒株的分离鉴定[D]. 杨立新.中国农业科学院 2016
[3]猪流行性腹泻病毒N蛋白基因的遗传变异及其原核表达[D]. 彭滔.四川农业大学 2013
[4]猪流行性腹泻病毒核衣壳蛋白亚细胞定位信号的鉴定[D]. 石达.中国农业科学院 2012
[5]应用噬菌体展示技术筛选抗猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体的模拟表位[D]. 王万利.中国农业科学院 2009
[6]抗猪轮状病毒VP6单克隆抗体的制备与鉴定[D]. 边亚娟.东北农业大学 2005
本文编号：3152656
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/dongwuyixue/3152656.html
