禽波氏杆菌免疫PCR检测方法的建立及其亚单位疫苗的研制

发布时间：2021-04-22 07:26

　　禽波氏杆菌（Bordetella avium, B. avium）最早于1967年分离自火鸡，该菌引起的禽波氏杆菌病是一种高度接触传染性疫病，具有高度上呼吸道接触传染性，1周龄内的雏禽最易感，主要引起禽类的鼻炎、眼炎等呼吸道症状，造成种鸡场孵化率降低、死胎率高和弱雏增加。在中国，朱瑞良教授在1991年首次报道了鸡波氏杆菌病，随后从病鸡眼中分离得到了禽波氏杆菌（朱瑞良，1994）。禽波氏杆菌可垂直传播，又可水平传播。禽波氏杆菌感染的同时，常常继发或并发感染免疫抑制病毒（ALV、REV、CIAV等）、大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌和荧光假单胞菌，使禽波氏杆菌病的危害不断放大。近几年，在全国不同地区经流行病学调查发现禽波氏杆菌的感染率在10%到50%之间，给我国的养禽业已经造成了巨大的经济损失，对该病做出及时快速的诊断及防控十分必要，因此，禽波氏杆菌快速灵敏的诊断方法的建立和疫苗的制备在预防禽波氏杆菌感染和及时诊断治疗方面显得尤为重要。本研究由以下五个部分组成：1.禽波氏杆菌外膜蛋白单克隆抗体的抗原识别位点分析对本试验室冻存的3株杂交瘤细胞株（3G10、4A3和4E8）进行复苏，经过3次有限稀释法... 

【文章来源】：山东农业大学山东省

【文章页数】：101 页

【学位级别】：博士

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符号说明及缩略词
中文摘要
ABSTRACT
1 引言
    1.1 禽波氏杆菌的研究现状
        1.1.1 禽波氏杆菌形态及培养特性
        1.1.2 禽波氏杆菌的生化特性
        1.1.3 禽波氏杆菌的抵抗力
        1.1.4 禽波氏杆菌的致病因子
        1.1.5 禽波氏杆菌病的流行病学
        1.1.6 禽波氏杆菌病的临床症状和病理变化
        1.1.7 禽波氏杆菌病的诊断方法
        1.1.8 禽波氏杆菌病的防治
    1.2 免疫 PCR 的研究进展
        1.2.1 免疫 PCR 的基本原理
        1.2.2 免疫 PCR 的类型
        1.2.3 免疫 PCR 系统
        1.2.4 免疫 PCR 的应用前景
    1.3 本研究的目的意义
2 材料与方法
    2.1 材料
        2.1.1 菌株、杂交瘤细胞株、质粒
        2.1.2 引物
        2.1.3 试验动物
        2.1.4 试剂及培养基
        2.1.5 主要培养基和试剂的配制
        2.1.6 仪器
    2.2 方法
        2.2.1 禽波氏杆菌外膜蛋白单克隆抗体的抗原识别位点分析
        2.2.2 免疫 PCR 技术检测禽波氏杆菌方法的建立
        2.2.3 免疫 PCR 检测禽波氏杆菌的应用研究
        2.2.4 禽波氏杆菌分离株抗原性与免疫原性差异分析
        2.2.5 禽波氏杆菌亚单位疫苗的研制及免疫效果研究
3 结果与分析
    3.1 禽波氏杆菌外膜蛋白单克隆抗体的抗原识别位点分析
        3.1.1 禽波氏杆菌外膜蛋白提取结果
        3.1.2 间接 ELISA 法检测单克隆抗体效价结果
        3.1.3 禽波氏杆菌外膜蛋白最适包被浓度测定
        3.1.4 单克隆抗体饱和曲线的制定结果
        3.1.5 单克隆抗体相加 ELISA 试验结果
        3.1.6 Western-blot 鉴定结果
    3.2 免疫 PCR 技术检测禽波氏杆菌方法的建立
        3.2.1 禽波氏杆菌分离株 Ba11 和 Ba15 的培养特性
        3.2.2 禽波氏杆菌多克隆抗体效价的测定结果
        3.2.3 生物素标记的报告 DNA 分子的制备
        3.2.4 报告 DNA 最适浓度的确定
        3.2.5 链霉亲和素最适浓度的确定
        3.2.6 间接 ELSIA 法对禽波氏杆菌的灵敏度检测结果
        3.2.7 免疫 PCR 法对禽波氏杆菌的灵敏度检测结果
        3.2.8 免疫 PCR 方法对禽波氏杆菌的特异性检测结果
    3.3 免疫 PCR 检测禽波氏杆菌的应用研究
        3.3.1 实验室保存菌株的检测
        3.3.2 病料组织的检测结果
        3.3.3 血清样品的检测结果
        3.3.4 人工感染雏鸡的症状
        3.3.5 免疫 PCR 方法对禽波氏杆菌定植时间的检测
    3.4 禽波氏杆菌分离株抗原性与免疫原性差异分析
        3.4.1 禽波氏杆菌分离株的培养特性
        3.4.2 禽波氏杆菌分离株抗原性测定结果
        3.4.3 禽波氏杆菌分离株交叉凝集试验结果
        3.4.4 免疫琼脂扩散试验结果
        3.4.5 各免疫组鸡血清抗体效价的结果
        3.4.6 攻毒保护试验结果
    3.5 禽波氏杆菌亚单位疫苗的研制及免疫效果研究
        3.5.1 禽波氏杆菌外膜蛋白的提取与含量测定
        3.5.2 松花粉多糖的提取
        3.5.3 禽波氏杆菌亚单位疫苗的制备
        3.5.4 禽波氏杆菌亚单位疫苗的无菌检验及安全检验结果
        3.5.5 血清抗体水平的测定结果
        3.5.6 血液淋巴细胞比率的测定结果
        3.5.7 脾淋巴细胞转化率的测定结果
        3.5.8 外周血中 CD4+、CD8+T 淋巴细胞亚群检测
        3.5.9 血清中 IFN-γ的检测结果
        3.5.10 血清中 IL-2 含量的测定
        3.5.11 免疫保护试验结果
4 讨论
5 结论
参考文献
致谢
攻读学位期间论文发表、录用情况


【参考文献】：
期刊论文
[1]猴免疫缺陷病毒p27蛋白单克隆抗体结合抗原表位的鉴定[J]. 李亮,林跃智,那雷,汤艳东,吕晓玲,周建华,曲娟娟.  中国预防兽医学报. 2011(09)
[2]免疫PCR技术检测肠出血型大肠埃希菌O157:H7[J]. 赵春燕,曹娜娜,王海河,梁松鹤.  临床检验杂志. 2010(05)
[3]副猪嗜血杆菌抗原性研究进展[J]. 张焕容.  动物医学进展. 2010(07)
[4]一例禽波氏杆菌病的治疗[J]. 黄昊洋,李逢慧,罗超,唐帅,李彬.  中国畜禽种业. 2008(22)
[5]AA肉鸡群中免疫抑制性病毒分子流行病学调查及对疫苗免疫效果影响分析[J]. 李新苍,朱瑞良,路建彪,刘红芹,王伟,胡晓娜.  中国兽医学报. 2008(10)
[6]免疫佐剂的研究现状及发展动态[J]. 赵萍,储岳峰,高鹏程,贺英,赵海燕,逯忠新.  中国畜禽种业. 2008(13)
[7]猪瘟病毒石门株与兔化弱毒疫苗株之间抗原差异的单克隆抗体分析[J]. 朱妍,李素,王文成,涂长春.  中国兽医科学. 2008(04)
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博士论文
[1]禽波氏杆菌的定植规律、基因分型以及与REV共感染的协同致病作用研究[D]. 杨萍萍.山东农业大学 2012

硕士论文
[1]禽波氏杆菌的生物学特性研究及血清分型的初步探索[D]. 马荣德.山东农业大学 2010
[2]免疫PCR技术检测肠出血性大肠埃希菌O157：H7[D]. 曹娜娜.吉林大学 2010
[3]禽波氏杆菌OMP单克隆抗体的制备及其生物学特性研究[D]. 刘冠华.山东农业大学 2009
[4]鸡主要胚胎性疫病病原人工共感染的试验研究[D]. 翁立雪.山东农业大学 2009
[5]禽波氏杆菌OMP标记抗体检测方法的建立及相关毒素生物学特性的检测[D]. 杨春晓.山东农业大学 2008
[6]用核酸探针和分子斑点杂交技术检测家禽病毒的核酸[D]. 王汉雷.山东农业大学 2007
[7]免疫PCR检测HIV-1 p24的实验研究[D]. 郑姬.第三军医大学 2007
[8]规模化种鸡场胚胎疾病病原学研究及禽波氏杆菌16SrRNA基因序列分析[D]. 刘红芹.山东农业大学 2006
[9]应用蛋白芯片和免疫PCR技术高效检测汉滩病毒的研究[D]. 陈佳.中国科学院研究生院（武汉病毒研究所） 2005



本文编号：3153385