利用琥珀正交系统拯救口蹄疫病毒的研究
发布时间：2021-04-22 15:09
口蹄疫（Foot-and-Mouth Disease,FMD）是由口蹄疫病毒引起的急性、热性、高度接触性传染的动物疫病。疫苗免疫是口蹄疫防控的主要措施。然而,常规疫苗常出现疫苗保护率不高、弱毒苗毒力返祖等现象而造成口蹄疫疾病的爆发。因此深入研究口蹄疫病毒的致病机制并制备保护率更佳、免疫效果更稳定的疫苗对口蹄疫的防控至关重要。本研究借助正交系统在体外拯救口蹄疫病毒。首先构建pCMV-EGFP-Tyr40-TAG突变体琥珀抑制真核表达质粒和正交氨酰tRNA合成酶/tRNA真核表达质粒,并共转染BHK-21细胞,通过G418和嘌呤霉素筛选、Western-blot鉴定,获得稳定表达正交氨酰tRNA合成酶/tRNA的细胞系,并鉴定该细胞系的稳定性。构建口蹄疫野生型质粒,分别构建表达VP1、VP2、VP3和3D蛋白的野生型质粒,并在不同位点引入TAG终止密码子获得VP1、VP2、VP3和3D蛋白的突变质粒,将野生型质粒和突变质粒分别转染稳定表达正交氨酰tRNA合成酶/tRNA细胞系中,Western-blot鉴定,筛选出能够在稳定表达正交氨酰tRNA合成酶/tRNA细胞系中表达目的蛋白的突变质粒...
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：60 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
abstract
英文缩略表
第一章 引言
1.1 口蹄疫病毒
1.1.1 5′端非编码区
1.1.2 开放阅读框
1.1.3 3′端非编码区
1.2 正交系统
1.2.1 遗传密码扩充技术
1.2.2 正交系统的定义和应用范围
1.2.3 琥珀正交系统
1.3 体外拯救口蹄疫病毒
1.3.1 反向遗传操作技术拯救口蹄疫病毒
1.3.2 运用正交系统拯救口蹄疫病毒
第二章 pCMV-EGFP野生型重组质粒和pCMV-EGFP-Tyr40-TAG突变体琥珀抑制真核表达质粒的构建
2.1 材料
2.1.1 实验材料
2.1.2 主要试剂
2.1.3 实验仪器
2.1.4 常用试剂配制
2.2 实验方法
2.2.1 pCMV-EGFP Wild Type野生型重组质粒的构建
2.2.2 pCMV-EGFP-Tyr40TAG琥珀抑制真核表达重组质粒的克隆及构建
2.3 结果
2.3.1 pCMV-EGFP-WT野生型重组质粒的构建
2.3.2 pEGFP-Tyr40TAG突变质粒的鉴定结果
2.4 结论与讨论
第三章 稳定表达正交氨酰t RNA合成酶/tRNA的细胞系的构建
3.1 实验材料
3.1.1 实验材料
3.1.2 实验试剂
3.1.3 实验仪器
3.2 实验方法
3.2.1 正交氨酰tRNA合成酶/tRNA真核表达质粒的构建
3.2.2 稳定表达正交氨酰tRNA合成酶/tRNA的细胞系的构建
3.2.3 单克隆细胞系的鉴定
3.3 实验结果
3.3.1 正交氨酰tRNA合成酶/tRNA真核表达质粒的构建
3.3.2 正交系统的鉴定结果
3.4 结论与讨论
第四章 口蹄疫病毒的体外拯救
4.1 实验材料
4.1.1 实验材料
4.1.2 主要试剂
4.1.3 主要仪器
4.2 实验方法
4.2.1 pFMDV-O/BY/CHA/2010 野生型重组质粒的构建
4.2.2 pFMDV-O/BY/CHA/2010-TAG突变质粒的构建
4.2.3 FMDV-O-WT野生型病毒和FMDV-O-TAG突变病毒的体外拯救
4.2.4 基因工程毒的鉴定
4.3 实验结果
4.3.1 pFMDV-O-WT野生型质粒的构建
4.3.2 TAG突变位点的筛选结果
4.3.3 pFMDV-O/BY/CHA/2010-TAG突变质粒的构建
4.3.4 RT-PCR扩增的结果
4.3.5 测序结果
4.3.6 细胞病变结果
4.4 结论与讨论
第五章 全文结论
参考文献
致谢
作者简历
【参考文献】：
期刊论文
[1]细胞内转录拯救Asia1型口蹄疫病毒[J]. 李平花,白兴文,卢曾军,孙普,郭建宏,李冬,曹伟军,陈应理,刘湘涛,殷宏,刘在新. 中国农业科学. 2009(02)
本文编号：3153991
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：60 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
abstract
英文缩略表
第一章 引言
1.1 口蹄疫病毒
1.1.1 5′端非编码区
1.1.2 开放阅读框
1.1.3 3′端非编码区
1.2 正交系统
1.2.1 遗传密码扩充技术
1.2.2 正交系统的定义和应用范围
1.2.3 琥珀正交系统
1.3 体外拯救口蹄疫病毒
1.3.1 反向遗传操作技术拯救口蹄疫病毒
1.3.2 运用正交系统拯救口蹄疫病毒
第二章 pCMV-EGFP野生型重组质粒和pCMV-EGFP-Tyr40-TAG突变体琥珀抑制真核表达质粒的构建
2.1 材料
2.1.1 实验材料
2.1.2 主要试剂
2.1.3 实验仪器
2.1.4 常用试剂配制
2.2 实验方法
2.2.1 pCMV-EGFP Wild Type野生型重组质粒的构建
2.2.2 pCMV-EGFP-Tyr40TAG琥珀抑制真核表达重组质粒的克隆及构建
2.3 结果
2.3.1 pCMV-EGFP-WT野生型重组质粒的构建
2.3.2 pEGFP-Tyr40TAG突变质粒的鉴定结果
2.4 结论与讨论
第三章 稳定表达正交氨酰t RNA合成酶/tRNA的细胞系的构建
3.1 实验材料
3.1.1 实验材料
3.1.2 实验试剂
3.1.3 实验仪器
3.2 实验方法
3.2.1 正交氨酰tRNA合成酶/tRNA真核表达质粒的构建
3.2.2 稳定表达正交氨酰tRNA合成酶/tRNA的细胞系的构建
3.2.3 单克隆细胞系的鉴定
3.3 实验结果
3.3.1 正交氨酰tRNA合成酶/tRNA真核表达质粒的构建
3.3.2 正交系统的鉴定结果
3.4 结论与讨论
第四章 口蹄疫病毒的体外拯救
4.1 实验材料
4.1.1 实验材料
4.1.2 主要试剂
4.1.3 主要仪器
4.2 实验方法
4.2.1 pFMDV-O/BY/CHA/2010 野生型重组质粒的构建
4.2.2 pFMDV-O/BY/CHA/2010-TAG突变质粒的构建
4.2.3 FMDV-O-WT野生型病毒和FMDV-O-TAG突变病毒的体外拯救
4.2.4 基因工程毒的鉴定
4.3 实验结果
4.3.1 pFMDV-O-WT野生型质粒的构建
4.3.2 TAG突变位点的筛选结果
4.3.3 pFMDV-O/BY/CHA/2010-TAG突变质粒的构建
4.3.4 RT-PCR扩增的结果
4.3.5 测序结果
4.3.6 细胞病变结果
4.4 结论与讨论
第五章 全文结论
参考文献
致谢
作者简历
【参考文献】：
期刊论文
[1]细胞内转录拯救Asia1型口蹄疫病毒[J]. 李平花,白兴文,卢曾军,孙普,郭建宏,李冬,曹伟军,陈应理,刘湘涛,殷宏,刘在新. 中国农业科学. 2009(02)
本文编号：3153991
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/dongwuyixue/3153991.html
