奶牛乳房炎链球菌和肠球菌的分离鉴定及毒力基因的检测

发布时间：2021-04-24 11:35

　　奶牛乳房炎病原种类多，不同地区患病奶样中分离到的链球菌差异很大，为了查明甘肃及周边地区链球菌引起的奶牛乳房炎的情况，共采集奶样382份，包括甘肃永登县260份、青海省民和县33份、宁夏吴忠市89份。预实验对吴忠来源的89份奶样进行了分析，经THB固体选择培养基初筛后，得到36株疑似链球菌，经色素试验和16s rRNA测序分析，其中8株为无乳链球菌28株为肠球菌属细菌（主要是粪肠球菌和屎肠球菌，且均能够在THB选择培养基、6.5%NaCL、45%胆汁、45℃培养基中生长）。因此认为肠球菌作为奶牛乳腺炎的一个主要病原，已经广泛存在于甘肃及周边地区。考虑到肠球菌本属于兰氏链球菌D群，决定对采集到的奶样进行链球菌和肠球菌分离及鉴定。继而以剩余的293份奶样为研究对象，同样通过THB固体选择培养基快速筛选出了46株疑似链球菌和肠球菌，结合吴忠分离结果，共得到了74株株疑似链球菌和肠球菌。克隆其16S～23S rRNA区间基因序列，做限制性片段多态性分型（RFLP），再根据分型结果，克隆各型任一菌株16S rRNA序列并测序。结果表明，74株疑似链球菌中有粪肠球菌56株（吴忠23株，明和4株，秦王... 

【文章来源】：甘肃农业大学甘肃省

【文章页数】：63 页

【学位级别】：硕士

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摘要
Summary
目录
缩略词表
第一章 文献综述
    1 引言
    2 奶牛乳房炎的发病原因
    3 链球菌性和肠球菌性乳房炎
        3.1 肠球菌和链球菌的关系
        3.2 引起奶牛乳房炎的链球菌和肠球菌
        3.3 链球菌和肠球菌的特征
        3.4 链球菌和肠球菌的致病机理
            3.4.1 链球菌致病机理
            3.4.2 肠球菌致病机理
                3.4.2.1 细胞溶血素（Cyl）
                3.4.2.2 明胶酶（GelE）
                3.4.2.3 肠球菌表面蛋白（Esp）
                3.4.2.4 肠球菌胶原蛋白粘附素（Ace）
                3.4.2.5 聚集物质（AS）
        3.5 链球菌性乳房炎
            3.5.1 环境链球菌性乳房炎
            3.5.2 传染性乳房炎
        3.6 链球菌性乳房炎的流行病学
        3.7 链球菌性乳房炎的防治措施
            3.7.1 做好饲养管理工作增强奶牛机体抵抗力
            3.7.2 链球菌乳房炎的治疗
                3.7.2.1 抗生素治疗
                3.7.2.2 非抗生素治疗
        3.8 人源性和动物源性肠球菌病的研究进展
    4 实验目的意义
第二章 研究内容
    实验一：奶牛乳房炎无乳链球菌的分离及 PCR 鉴定
        1.材料与方法
            1.1 待检材料
            1.2 主要设备及试剂
                1.2.1 主要设备
                1.2.2 试剂
            1.3 方法
                1.3.1 无乳链球菌的分离
                1.3.2 细菌分子鉴定
                1.3.3 PCR 扩增片段的琼脂糖凝胶回收
                1.3.4 PCR 产物连接 T 载体
                1.3.5 转化大肠杆菌 DH5a 感受态细胞
        2.结果
            2.1 无乳链球菌分离结果
            2.2 病原菌与菌落形态
            2.3 无乳链球菌 DNA 提取结果
            2.4 16s rRNA 与 cfb 基因及系统发育分析
        3.讨论
    实验二：利用 16s～23s rRNA RFLP 分型及 16s rRNA 基因序列鉴定奶牛乳房炎链球菌和肠球菌
        1.材料与方法
            1.1 待检材料
            1.2 主要试剂及菌株
                1.2.1 试剂
                1.2.2 菌株
            1.3 方法
                1.3.1 细菌分离与纯化
                1.3.2 细菌 16s rRNA 基因和 16s～23s rRNA 区间基因的克隆
                1.3.3 16s rRNA 扩增片段的琼脂糖凝胶回收
                1.3.4 参考菌株和分离株细菌 16s～23s rRNA 基因扩增产物的 RFLP 分析
                1.3.5 16s rRNA 基因测序
        2.结果
            2.1 细菌分离结果
            2.2 16s rRNA 和 16s～23s rRNA 基因扩增
            2.3 16s～23s rRNA 基因 RFLP 酶切分析结果
            2.4 分离株 16s～23s rRNA 基因 RFLP 归类和 16s rRNA 测序结果
        3.讨论
    实验三：牛源性肠球菌的分离鉴定及毒力因子基因的检测
        1 材料与方法
            1.1 菌株
            1.2 主要试剂
            1.3 方法
                1.3.1 肠球菌的分离鉴定
                    1.3.1.1 样品采集与初步鉴定无菌
                    1.3.1.2 可疑菌株的 PCR 鉴定
                1.3.2 6 种毒力因子基因的检测
                    1.3.2.1 引物的设计
                    1.3.2.2 PCR 扩增及测序
        2 结果
            2.1 肠球菌的分离鉴定
            2.2 扩增产物的琼脂糖凝胶电泳
            2.3 分离菌株对 6 种毒力因子基因的携带情况
            2.4 毒力基因组合情况
        3 讨论
总结论
参考文献
致谢
作者简介
导师简介



本文编号：3157291