猪博卡病毒的全基因组序列分析及检测方法建立
发布时间：2021-04-28 06:21
猪博卡病毒（Porcine bocavirus,PBoV）属于细小病毒科、细小病毒亚科、博卡病毒属。该病毒是引起猪群腹泻、呼吸系统疾病以及断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）的重要病原。该病毒自2009年被检出以后,已相继在世界各国报道。近年来,PBoV在我国的感染率日益升高,且常与其他病原混合感染,增加了疫病防控的难度。PBoV分不同的基因型,并且各基因型毒株在猪群中流行情况不一,给养猪业造成了一定的经济损失。因此,了解PBoV河北地区流行毒株的基因组结构、基因型特征,并建立相应的检测方法对疾病的流行病学调查、准确诊断、预防及动态监控具有重大意义。本研究从河北省一严重腹泻病发病猪场检测到PBoV,将其命名为PBoV/CH/HB/HD/2017株,并对该病毒展开了一系列研究:（1）为了解PBoV/CH/HB/HD/2017株的基因组结构及特点,本研究对该毒株进行了全基因组序列扩增,并分别进行了同源性分析及进化树分析。研究结果表明,PBoV/CH/HB/HD/2017株与25条参考株之间的核苷酸同源性为40.5%–99.4%,并且与中国毒株Bocavirus pig/SX/China/2...
【文章来源】：河北农业大学河北省
【文章页数】：63 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
abstract
1 引言
1.1 猪博卡病毒概述
1.1.1 猪博卡病毒形态特性及基因组结构
1.1.2 猪博卡病毒的分型研究
1.1.3 猪博卡病毒在国内外的流行病学研究
1.1.4 猪博卡病毒的培养特性
1.1.5 猪博卡病毒发病特点及致病机制分析
1.2 猪博卡病毒实验室诊断技术
1.2.1 普通PCR诊断技术
1.2.2 荧光定量PCR诊断技术
1.2.3 间接免疫荧光诊断技术
1.2.4 环介导等温扩增诊断技术
1.2.5 酶联免疫吸附试验诊断技术
1.2.6 其他诊断技术
1.3 研究的目的及意义
2 材料与方法
2.1 材料
2.1.1 阳性材料、血清样本及组织样本
2.1.2 试验所用试剂
2.1.3 试验所用溶液
2.1.4 主要仪器设备
2.2 方法
2.2.1 猪博卡病毒全基因组序列扩增及分析
2.2.2 猪博卡病毒NP1 重组表达质粒的构建
2.2.3 重组表达质粒pET-NP1 的蛋白表达、纯化及鉴定
2.2.4 基于pET-NP1 重组蛋白的猪博卡病毒间接ELISA诊断方法建立
2.2.5 猪博卡病毒和猪流行性腹泻病毒双重荧光定量PCR方法的建立
2.2.6 猪博卡病毒和猪圆环2 型病毒双重荧光定量PCR检测方法的建立
3 结果
3.1 猪博卡病毒全基因序列扩增及分析
3.1.1 猪博卡病毒PCR扩增结果
3.1.2 猪博卡病毒全基因组序列的拼接及结构分析
3.1.3 猪博卡病毒全基因组序列分析
3.2 猪博卡病毒NP1 重组表达质粒构建结果
3.2.1 猪博卡病毒NP1 表达基因的PCR扩增
3.2.2 重组表达质粒的酶切鉴定鉴定结果
3.3 重组表达质粒pET-NP1 的蛋白表达、纯化及鉴定结果
3.3.1 重组表达质粒pET-NP1 的蛋白表达结果
3.3.2 重组pET-NP1 蛋白纯化结果
3.3.3 重组pET-NP1 蛋白Western-blotting鉴定
3.4 猪博卡病毒重组pET-NP1 蛋白间接ELISA诊断方法建立
3.4.1 间接ELISA最佳抗原包被浓度及最优血清稀释倍数
3.4.2 最优封闭液的确定
3.4.3 最适包被条件的确定
3.4.4 最佳酶标抗体浓度的确定
3.4.5 ELISA临界值的确定
3.4.6 重复性试验
3.4.7 特异性试验
3.4.8 临床样品的检测
3.5 猪博卡病毒和猪流行性腹泻病毒双重荧光定量PCR方法的建立
3.5.1 PBoV和 PEDV质粒标准品的制备
3.5.2 反应体系和反应条件的优化
3.5.3 标准曲线的建立
3.5.4 特异性试验
3.5.5 敏感性试验
3.5.6 重复性试验
3.5.7 临床样品检测
3.6 猪博卡病毒和猪圆环病毒2 型双重荧光定量PCR方法的建立
3.5.1 PBoV和 PCV2 质粒标准品的制备
3.5.2 反应体系和反应条件的优化
3.5.3 标准曲线的建立
3.5.4 特异性试验
3.5.5 敏感性试验
3.5.6 重复性试验
3.5.7 临床样品检测
4 讨论
4.1 猪博卡病毒全基因组序列扩增
4.2 猪博卡病毒重组pET-NP1 蛋白间接ELISA诊断方法建立
4.3 猪博卡病毒和猪流行性腹泻病毒荧光定量PCR检测方法的建立
4.4 猪博卡病毒和猪圆环病毒2 型荧光定量PCR检测方法的建立
5 结论
参考文献
作者简介
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]猪流行性腹泻病毒和猪博卡病毒3/4/5型双重PCR检测方法的建立[J]. 韩昊莹,张鸿鑫,徐朋丽,乔涵,张宇,杨兴武,陈红英. 中国预防兽医学报. 2018(03)
[2]猪博卡病毒病原学和检测方法研究进展[J]. 汪洋,李玲,李真,李峰. 动物医学进展. 2017(04)
[3]猪博卡病毒PCR检测方法的建立及初步应用[J]. 周宇,李春萍,朱事康,宋斯伟,徐鹏,陈燕忠,栾维民. 中国预防兽医学报. 2016(09)
[4]猪博卡病毒1型/2型PCR检测方法的建立[J]. 付朋飞,李梦奇,乔涵,杨兴武,张宇,徐朋丽,韩昊莹,张鸿鑫,陈红英. 中国预防兽医学报. 2016(07)
[5]猪博卡病毒3/4/5型PCR检测方法的建立及应用[J]. 付朋飞,杨兴武,乔涵,潘鑫龙,郭晓庆,张宇,郭珍珍,陈红英. 中国兽医学报. 2016(06)
[6]四川规模化猪场腹泻仔猪病毒性腹泻病原的分子检测[J]. 蔡雨函,周远成,艾能,李碧,潘梦. 猪业科学. 2016(02)
[7]猪博卡病毒病原学及其检测技术的研究进展[J]. 李达,韦国渠,汤德元,李春燕,曾智勇,郝飞,刘建,王洪光. 黑龙江畜牧兽医. 2015(11)
[8]猪博卡病毒NP1基因特异性的PCR方法建立及应用[J]. 叶星宇,聂奎,聂福平. 西南大学学报(自然科学版). 2015(05)
[9]猪博卡病毒NP1基因的克隆及其生物信息学分析[J]. 郑英帅,左奕,柴瑞影,戚妍,李雅楠,袁万哲,孙继国. 河南农业科学. 2015(03)
[10]猪博卡病毒5型SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立[J]. 陈鹏强,胡崇伟,陈秋勇,林群群,修金生. 中国兽医科学. 2015(02)
博士论文
[1]猪博卡病毒类病毒颗粒的表达以及在流行病学方面的应用[D]. 张文静.山东大学 2016
硕士论文
[1]猪丁型冠状病毒检测方法的建立及初步应用[D]. 罗尚星.河北农业大学 2018
[2]猪丁型冠状病毒HB-BD株分离鉴定及生物学特性研究[D]. 刘宝京.河北农业大学 2018
[3]猪博卡病毒间接ELISA方法的建立及与PCV2共感染对细胞的影响[D]. 张晶.华中农业大学 2017
[4]猪博卡病毒VP2蛋白的原核表达与间接ELISA检测方法的建立及应用[D]. 蔡高峰.江西农业大学 2017
[5]猪博卡病毒间接ELISA诊断方法的建立[D]. 郑英帅.河北农业大学 2015
本文编号：3164974
【文章来源】：河北农业大学河北省
【文章页数】：63 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
abstract
1 引言
1.1 猪博卡病毒概述
1.1.1 猪博卡病毒形态特性及基因组结构
1.1.2 猪博卡病毒的分型研究
1.1.3 猪博卡病毒在国内外的流行病学研究
1.1.4 猪博卡病毒的培养特性
1.1.5 猪博卡病毒发病特点及致病机制分析
1.2 猪博卡病毒实验室诊断技术
1.2.1 普通PCR诊断技术
1.2.2 荧光定量PCR诊断技术
1.2.3 间接免疫荧光诊断技术
1.2.4 环介导等温扩增诊断技术
1.2.5 酶联免疫吸附试验诊断技术
1.2.6 其他诊断技术
1.3 研究的目的及意义
2 材料与方法
2.1 材料
2.1.1 阳性材料、血清样本及组织样本
2.1.2 试验所用试剂
2.1.3 试验所用溶液
2.1.4 主要仪器设备
2.2 方法
2.2.1 猪博卡病毒全基因组序列扩增及分析
2.2.2 猪博卡病毒NP1 重组表达质粒的构建
2.2.3 重组表达质粒pET-NP1 的蛋白表达、纯化及鉴定
2.2.4 基于pET-NP1 重组蛋白的猪博卡病毒间接ELISA诊断方法建立
2.2.5 猪博卡病毒和猪流行性腹泻病毒双重荧光定量PCR方法的建立
2.2.6 猪博卡病毒和猪圆环2 型病毒双重荧光定量PCR检测方法的建立
3 结果
3.1 猪博卡病毒全基因序列扩增及分析
3.1.1 猪博卡病毒PCR扩增结果
3.1.2 猪博卡病毒全基因组序列的拼接及结构分析
3.1.3 猪博卡病毒全基因组序列分析
3.2 猪博卡病毒NP1 重组表达质粒构建结果
3.2.1 猪博卡病毒NP1 表达基因的PCR扩增
3.2.2 重组表达质粒的酶切鉴定鉴定结果
3.3 重组表达质粒pET-NP1 的蛋白表达、纯化及鉴定结果
3.3.1 重组表达质粒pET-NP1 的蛋白表达结果
3.3.2 重组pET-NP1 蛋白纯化结果
3.3.3 重组pET-NP1 蛋白Western-blotting鉴定
3.4 猪博卡病毒重组pET-NP1 蛋白间接ELISA诊断方法建立
3.4.1 间接ELISA最佳抗原包被浓度及最优血清稀释倍数
3.4.2 最优封闭液的确定
3.4.3 最适包被条件的确定
3.4.4 最佳酶标抗体浓度的确定
3.4.5 ELISA临界值的确定
3.4.6 重复性试验
3.4.7 特异性试验
3.4.8 临床样品的检测
3.5 猪博卡病毒和猪流行性腹泻病毒双重荧光定量PCR方法的建立
3.5.1 PBoV和 PEDV质粒标准品的制备
3.5.2 反应体系和反应条件的优化
3.5.3 标准曲线的建立
3.5.4 特异性试验
3.5.5 敏感性试验
3.5.6 重复性试验
3.5.7 临床样品检测
3.6 猪博卡病毒和猪圆环病毒2 型双重荧光定量PCR方法的建立
3.5.1 PBoV和 PCV2 质粒标准品的制备
3.5.2 反应体系和反应条件的优化
3.5.3 标准曲线的建立
3.5.4 特异性试验
3.5.5 敏感性试验
3.5.6 重复性试验
3.5.7 临床样品检测
4 讨论
4.1 猪博卡病毒全基因组序列扩增
4.2 猪博卡病毒重组pET-NP1 蛋白间接ELISA诊断方法建立
4.3 猪博卡病毒和猪流行性腹泻病毒荧光定量PCR检测方法的建立
4.4 猪博卡病毒和猪圆环病毒2 型荧光定量PCR检测方法的建立
5 结论
参考文献
作者简介
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]猪流行性腹泻病毒和猪博卡病毒3/4/5型双重PCR检测方法的建立[J]. 韩昊莹,张鸿鑫,徐朋丽,乔涵,张宇,杨兴武,陈红英. 中国预防兽医学报. 2018(03)
[2]猪博卡病毒病原学和检测方法研究进展[J]. 汪洋,李玲,李真,李峰. 动物医学进展. 2017(04)
[3]猪博卡病毒PCR检测方法的建立及初步应用[J]. 周宇,李春萍,朱事康,宋斯伟,徐鹏,陈燕忠,栾维民. 中国预防兽医学报. 2016(09)
[4]猪博卡病毒1型/2型PCR检测方法的建立[J]. 付朋飞,李梦奇,乔涵,杨兴武,张宇,徐朋丽,韩昊莹,张鸿鑫,陈红英. 中国预防兽医学报. 2016(07)
[5]猪博卡病毒3/4/5型PCR检测方法的建立及应用[J]. 付朋飞,杨兴武,乔涵,潘鑫龙,郭晓庆,张宇,郭珍珍,陈红英. 中国兽医学报. 2016(06)
[6]四川规模化猪场腹泻仔猪病毒性腹泻病原的分子检测[J]. 蔡雨函,周远成,艾能,李碧,潘梦. 猪业科学. 2016(02)
[7]猪博卡病毒病原学及其检测技术的研究进展[J]. 李达,韦国渠,汤德元,李春燕,曾智勇,郝飞,刘建,王洪光. 黑龙江畜牧兽医. 2015(11)
[8]猪博卡病毒NP1基因特异性的PCR方法建立及应用[J]. 叶星宇,聂奎,聂福平. 西南大学学报(自然科学版). 2015(05)
[9]猪博卡病毒NP1基因的克隆及其生物信息学分析[J]. 郑英帅,左奕,柴瑞影,戚妍,李雅楠,袁万哲,孙继国. 河南农业科学. 2015(03)
[10]猪博卡病毒5型SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立[J]. 陈鹏强,胡崇伟,陈秋勇,林群群,修金生. 中国兽医科学. 2015(02)
博士论文
[1]猪博卡病毒类病毒颗粒的表达以及在流行病学方面的应用[D]. 张文静.山东大学 2016
硕士论文
[1]猪丁型冠状病毒检测方法的建立及初步应用[D]. 罗尚星.河北农业大学 2018
[2]猪丁型冠状病毒HB-BD株分离鉴定及生物学特性研究[D]. 刘宝京.河北农业大学 2018
[3]猪博卡病毒间接ELISA方法的建立及与PCV2共感染对细胞的影响[D]. 张晶.华中农业大学 2017
[4]猪博卡病毒VP2蛋白的原核表达与间接ELISA检测方法的建立及应用[D]. 蔡高峰.江西农业大学 2017
[5]猪博卡病毒间接ELISA诊断方法的建立[D]. 郑英帅.河北农业大学 2015
本文编号：3164974
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