Cre/loxp重组系统介导转基因绒山羊标记基因删除的研究

发布时间：2021-05-08 02:29

　　细胞核移植技术和转基因技术的发展为动物新品种的培育提供了新的技术平台。然而利用上述技术在转入目的基因的过程中,为了便于筛选,同时也转入了标记基因,抗生素抗性基因和荧光标记基因是常用的标记基因。标记基因的应用引起了人们对其安全性方面的关注和担忧。而本研究的目的在于应用Cre/loxp重组系统,实现标记基因的安全删除。本研究首先给带有K14启动子的VEGF164基因两端带上两个相同方向的loxp位点,之后与pDsReD2-1载体连接,成功构建了表达载体pDsReD2-1-K14-VEGF-LOXP。之后用表达载体转染绒山羊胎儿成纤维细胞,筛选出纯度较高的转基因细胞克隆。获得的细胞克隆一部分用于生产转基因克隆绒山羊胚胎,经胚胎移植后获得了转基因的绒山羊,今后可以利用该转基因绒山羊的体细胞进行标记基因的删除研究。另一部分用带有信号肽片段的重组Cre酶即HTNC酶处理,用以检测不同的处理时间对转基因细胞标记基因删除效果的影响。收集不同处理时间的转基因细胞,并通过实时荧光定量PCR检测标记基因的去除效果,结果显示标记基因被部分去除,且最佳处理时间为3小时。本研究结果不但可以为今后核移植生产无标记基... 

【文章来源】：内蒙古大学内蒙古自治区 211工程院校

【文章页数】：64 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
缩略词表
第一部分 文献综述
    一、标记基因删除的方法
    二、Cre/loxp重组系统的分子机制
    三、Cre/loxp系统的应用
    参考文献
第二部分 实验研究
    第一章 表达载体pDsReD2-1-K14-VEGF-LOXP的构建
        1 材料
            1.1 载体与菌种
            1.2 试剂与耗材
        2 方法
            2.1 K14-VEGF-LOXP序列的克隆
            2.2 表达载体pDsReD2-1-K14-VEGF-LOXP的构建
            2.3 表达载体的PCR和酶切鉴定
            2.4 表达载体的线性化
        3 结果
            3.1 K14-VEGF-LOXP序列克隆与分析
            3.2 表达载体的鉴定
        4 讨论
    第二章 绒山羊转基因细胞系的建立及标记基因的删除
        1 材料
            1.1 实验仪器
            1.2 活体实验材料
            1.3 菌液
            1.4 试剂耗材
            1.5 溶液配制
        2 方法
            2.1 绒山羊胎儿成纤维细胞分离与培养
            2.2 绒山羊胎儿成纤维细胞的传代及冻存
            2.3 绒山羊胎儿成纤维细胞的解冻及复苏
            2.4 绒山羊胎儿成纤维细胞的性别鉴定
            2.5 绒山羊胎儿成纤维细胞生长曲线的测定
            2.6 绒山羊胎儿成纤维细胞的转染与筛选
            2.7 转基因绒山羊胎儿成纤维细胞的鉴定
            2.8 转基因绒山羊成纤维细胞标记基因的删除
            2.9 荧光定量PCR检测标记基因的删除效果
        3 结果
            3.1 绒山羊胎儿成纤维细胞的培养
            3.2 绒山羊胎儿成纤维细胞的性别鉴定
            3.3 绒山羊胎儿成纤维细胞生长曲线的绘制
            3.4 绒山羊胎儿成纤维细胞的转染
            3.5 转表达载体绒山羊成纤维细胞的转基因鉴定
            3.6 转基因绒山羊成纤维细胞标记基因的删除
            3.7 荧光定量PCR检测标记基因的删除效果
        4 讨论
    第三章 转基因胚胎的制备与转基因绒山羊的生产
        1 材料
            1.1 实验仪器
            1.2 实验材料
            1.3 试剂耗材
            1.4 溶液配制
        2 方法
            2.1 卵母细胞体外成熟
            2.2 转基因绒山羊克隆胚胎的制备及发育
            2.3 受体母羊的准备
            2.4 转基因克隆胚胎的移植及产羔
            2.5 转基因绒山羊的鉴定
        3 结果
            3.1 转基因克隆胚胎的发育
            3.2 转基因克隆胚胎的移植及产羔
            3.3 转基因绒山羊的鉴定
            3.4 转基因绒山羊的解剖
        4 讨论
参考文献
结论
致谢
附录1
硕士期间发表论文


【参考文献】：
期刊论文
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[10]内蒙古罕山白绒山羊毛囊生长规律的研究[J]. 金凤,李金泉,刘东军,乌云格日乐,韩强.  中国草食动物. 2008(01)

博士论文
[1]阿尔巴斯白绒山羊与绵羊胚胎干细胞培养技术的研究[D]. 靳木子.内蒙古大学 2013

硕士论文
[1]骨骼肌特异表达卵泡抑制素基因转基因绵羊研究[D]. 王玮.内蒙古大学 2011



本文编号：3174493