宿主蛋白PHB对H5N1亚型禽流感病毒增殖的影响
发布时间：2021-05-12 03:43
H5N1高致病性禽流感病毒（HPAIV）危害严重,不仅能引起家禽的大量死亡,造成巨大经济损失,而且还常常引起人发病,严重者可至人死亡。研究流感病毒与宿主相互作用关系,对于阐释流感病毒的致病机理至关重要。前期以实验室分离到的一株H5N1高致病性禽流感病毒感染A549细胞,利用蛋白质组学的方法,鉴定了一些差异表达的宿主蛋白,其中PHB蛋白表达水平在病毒感染宿主细胞后明显上调。因此,本研究进一步对其功能进行研究。主要研究成果如下:1.利用Real-time RT-PCR和western blot的方法检测A549细胞感染HPAIV后,PHB在不同时间点mRNA和蛋白水平的上调表达。2.构建了 PHB的真核表达质粒,通过Real-time RT-PCR和western blot验证其表达效果良好。在转染A549细胞后,用H5N1禽流感病毒感染细胞,利用Real-time RT-PCR、western blot、间接免疫荧光的方法证明在H5N1禽流感病毒感染A549细胞后,PHB促进病毒蛋白NP的合成。通过病毒蚀斑实验证明在H5N1禽流感病毒感染A549细胞后,PHB增加上清中的病毒滴度。均证明...
【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：59 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略语表(Abbreviation)
1 文献综述
1.1 流感病毒简介
1.2 流感病毒与细胞凋亡
1.2.1 细胞凋亡
1.2.2 流感病毒诱导细胞凋亡
1.3 流感病毒与Ⅰ型干扰素
1.3.1 Ⅰ型干扰素(IFNα/β)的产生与应答
1.3.2 Ⅰ型干扰素(IFNα/β)的抗流感病毒作用
1.3.3 流感病毒对干扰素的抑制作用
1.4 PHB家族简介
1.4.1 PHB家族的组成
1.4.2 PHB家族蛋白结构
1.4.3 PHB复合物定位
1.4.4 PHB维持线粒体的发育与功能
1.4.5 PHB调节细胞凋亡
1.4.6 PHB与E2F/Rb
1.4.7 PHB与p53
1.4.8 参与IL6 JAK-STAT通路
1.4.9 参与Raf-MEK-ERK通路
2 研究目的与意义
3 材料与方法
3.1 材料
3.1.1 质粒、菌株和病毒
3.1.2 细胞培养,转染相关试剂
3.1.3 细菌培养基及抗生素的配制
3.1.4 主要酶和试剂盒
3.1.5 RNA抽提及荧光定量试剂
3.1.6 SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳及Western Blot相关试剂
3.1.7 抗体
3.1.8 主要分子生物学软件及数据库
3.1.9 主要实验仪器及设备
3.2 方法
3.2.1 PCR的扩增、产物的纯化回收、载体连接及测序
3.2.2 去内毒素质粒的提取
3.2.3 病毒蚀斑实验
3.2.4 人肺泡上皮细胞(A549)的培养
3.2.5 A549细胞的感染实验
3.2.6 A549细胞的转染
3.2.7 293T细胞的转染
3.2.8 细胞总RNA的提取及DNase处理
3.2.9 总RNA的反转录
3.2.10 SYBR green Real-time RT-PCR
3.2.11 Real-time RT-PCR数据分析
3.2.12 Western blot蛋白样品的制备
3.2.13 考马斯亮蓝G250染色液蛋白定量法
3.2.14 Western blot
3.2.15 间接免疫荧光
3.2.16 双荧光素酶活性检测
3.2.17 统计学方法
4 结果与分析
4.1 H5N1禽流感DW毒株病毒滴度的测定
4.2 H5N1禽流感病毒感染A549细胞对PHB mRNA水平的影响
4.3 H5N1禽流感病毒感染A549细胞对PHB蛋白水平的影响
4.4 PHB对H5N1禽流感病毒增殖的影响
4.4.1 真核表达质粒pCMV-PHB的构建及表达效果验证
4.4.2 PHB促进A549细胞内病毒蛋白的合成
4.4.3 病毒蚀斑实验检测上清中的病毒滴度
4.5 PHB亚细胞定位研究
4.6 PHB对A549细胞凋亡的影响
4.7 PHB对Ⅰ型干扰素应答通路的影响
4.7.1 pCMV-PHB在293T细胞上的表达效果验证
4.7.2 双荧光素酶检测PHB对IFNβ启动子活性的影响
4.7.3 双荧光素酶检测PHB对ISRE启动子活性的影响
4.7.4 Real -time RT-PCR检测PHB对ISGs表达的影响
4.7.5 PHB抑制STAT1和STAT2的表达
5 讨论
5.1 H5N1禽流感病毒感染对PHB表达的影响
5.2 PHB对H5N1禽流感病毒增殖的影响
5.3 PHB亚细胞定位研究
5.4 PHB对A549细胞凋亡的影响
5.5 PHB对Ⅰ型干扰素应答通路的影响
6 小结
6.1 主要结论
6.2 值得进一步探索的问题
参考文献
致谢
本文编号：3182664
【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：59 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略语表(Abbreviation)
1 文献综述
1.1 流感病毒简介
1.2 流感病毒与细胞凋亡
1.2.1 细胞凋亡
1.2.2 流感病毒诱导细胞凋亡
1.3 流感病毒与Ⅰ型干扰素
1.3.1 Ⅰ型干扰素(IFNα/β)的产生与应答
1.3.2 Ⅰ型干扰素(IFNα/β)的抗流感病毒作用
1.3.3 流感病毒对干扰素的抑制作用
1.4 PHB家族简介
1.4.1 PHB家族的组成
1.4.2 PHB家族蛋白结构
1.4.3 PHB复合物定位
1.4.4 PHB维持线粒体的发育与功能
1.4.5 PHB调节细胞凋亡
1.4.6 PHB与E2F/Rb
1.4.7 PHB与p53
1.4.8 参与IL6 JAK-STAT通路
1.4.9 参与Raf-MEK-ERK通路
2 研究目的与意义
3 材料与方法
3.1 材料
3.1.1 质粒、菌株和病毒
3.1.2 细胞培养,转染相关试剂
3.1.3 细菌培养基及抗生素的配制
3.1.4 主要酶和试剂盒
3.1.5 RNA抽提及荧光定量试剂
3.1.6 SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳及Western Blot相关试剂
3.1.7 抗体
3.1.8 主要分子生物学软件及数据库
3.1.9 主要实验仪器及设备
3.2 方法
3.2.1 PCR的扩增、产物的纯化回收、载体连接及测序
3.2.2 去内毒素质粒的提取
3.2.3 病毒蚀斑实验
3.2.4 人肺泡上皮细胞(A549)的培养
3.2.5 A549细胞的感染实验
3.2.6 A549细胞的转染
3.2.7 293T细胞的转染
3.2.8 细胞总RNA的提取及DNase处理
3.2.9 总RNA的反转录
3.2.10 SYBR green Real-time RT-PCR
3.2.11 Real-time RT-PCR数据分析
3.2.12 Western blot蛋白样品的制备
3.2.13 考马斯亮蓝G250染色液蛋白定量法
3.2.14 Western blot
3.2.15 间接免疫荧光
3.2.16 双荧光素酶活性检测
3.2.17 统计学方法
4 结果与分析
4.1 H5N1禽流感DW毒株病毒滴度的测定
4.2 H5N1禽流感病毒感染A549细胞对PHB mRNA水平的影响
4.3 H5N1禽流感病毒感染A549细胞对PHB蛋白水平的影响
4.4 PHB对H5N1禽流感病毒增殖的影响
4.4.1 真核表达质粒pCMV-PHB的构建及表达效果验证
4.4.2 PHB促进A549细胞内病毒蛋白的合成
4.4.3 病毒蚀斑实验检测上清中的病毒滴度
4.5 PHB亚细胞定位研究
4.6 PHB对A549细胞凋亡的影响
4.7 PHB对Ⅰ型干扰素应答通路的影响
4.7.1 pCMV-PHB在293T细胞上的表达效果验证
4.7.2 双荧光素酶检测PHB对IFNβ启动子活性的影响
4.7.3 双荧光素酶检测PHB对ISRE启动子活性的影响
4.7.4 Real -time RT-PCR检测PHB对ISGs表达的影响
4.7.5 PHB抑制STAT1和STAT2的表达
5 讨论
5.1 H5N1禽流感病毒感染对PHB表达的影响
5.2 PHB对H5N1禽流感病毒增殖的影响
5.3 PHB亚细胞定位研究
5.4 PHB对A549细胞凋亡的影响
5.5 PHB对Ⅰ型干扰素应答通路的影响
6 小结
6.1 主要结论
6.2 值得进一步探索的问题
参考文献
致谢
本文编号：3182664
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