外泌体在口蹄疫病毒进行细胞间传播中的作用研究

发布时间：2021-05-12 08:11

　　外泌体是一种细胞分泌的起源于内体的胞外小囊泡,外泌体可以介导胞内蛋白、mRNA、miRNA的细胞间转运,这些外泌体中所包含的分子可在一定程度上调节靶细胞的生理活动。有研究报道了病毒或病毒RNA可以借助外泌体在细胞间传播,以此逃避宿主免疫系统的识别与清除。口蹄疫病毒是一种单股正链RNA病毒,病毒在与受体结合后进入细胞内部并在内体中释放出病毒RNA。外泌体起源于内体,在空间上外泌体的起源与病毒的复制周期存在交叉点。首先,从细胞培养液中富集了细胞感染病毒后所分泌的外泌体。在获得外泌体样品后,分别利用透射电镜观察外泌体,免疫印迹分析外泌体标志物以及纳米粒径测定样品粒径范围,证实获得了较高纯度的外泌体样品。在将外泌体样品孵育细胞后,我们观察到细胞发生了类似口蹄疫病毒感染造成的细胞病变,并且在细胞中可以检测到病毒蛋白的存在。在使用外泌体生成抑制剂处理细胞后,我们发现外泌体中病毒的拷贝数随着外泌体的抑制明显减少。这些实验结果表明外泌体可以携带病毒的感染性成分。从感染了口蹄疫病毒的细胞所分泌的外泌体中提取总RNA,然后利用PCR技术能够扩增到病毒的基因组全长。利用RNA原位杂交技术,在共聚焦显微镜下可... 

【文章来源】：中国农业科学院北京市

【文章页数】：50 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
abstract
主要符号对照表
第一章 绪论
    1.1 外泌体研究进展
        1.1.1 外泌体的来源
        1.1.2 外泌体富集与鉴定方法
        1.1.3 外泌体中所包含的成分
        1.1.4 外泌体的功能
    1.2 口蹄疫与口蹄疫病毒研究进展
        1.2.1 口蹄疫
        1.2.2 口蹄疫病毒病原学
        1.2.3 宿主细胞对口蹄疫病毒的抵抗作用
    1.3 外泌体在病毒感染中的研究进展
        1.3.1 外泌体携带病毒感染性成分进行传播
        1.3.2 病毒借助外泌体进行传播时的特点
    1.4 研究目的与意义
第二章 外泌体的富集与鉴定
    2.1 实验材料
        2.1.1 主要实验试剂与材料
        2.1.2 主要仪器及设备
    2.2 实验方法
        2.2.1 细胞传代培养
        2.2.2 FMDV感染细胞
        2.2.3 外泌体的富集
        2.2.4 透射电镜观察负染外泌体样品的制备
        2.2.5 SDS-PAGE电泳相关制品的配制
        2.2.6 免疫印迹验证外泌体的标志蛋白
        2.2.7 外泌体样品的纳米粒径范围的测定
    2.3 实验结果
        2.3.1 透射电镜下可观察外泌体
        2.3.2 免疫印迹法可以检测到外泌体的标志蛋白
        2.3.3 样品的粒径范围符合外泌体样品的粒径范围
    2.4 讨论
第三章 外泌体携带FMDV感染性成分感染靶细胞
    3.1 实验材料
        3.1.1 主要实验试剂与材料
        3.1.2 主要仪器及设备
    3.2 实验方法
        3.2.1 细胞孵育外泌体
        3.2.2 外泌体的抑制实验
            3.2.2.1 抑制剂处理细胞
            3.2.2.2 外泌体中总RNA的提取
            3.2.2.3 细胞总RNA的提取
            3.2.2.4 绝对定量法测定各组样品中的病毒RNA拷贝数
    3.3 实验结果
        3.3.1 细胞孵育外泌体后造成细胞感染
        3.3.2 病毒随着外泌体分泌的抑制而减少
    3.4 讨论
第四章 病毒RNA借助外泌体进行传播
    4.1 实验材料
        4.1.1 主要实验试剂与材料
        4.1.2 主要仪器及设备
    4.2 实验方法
        4.2.1 RT-PCR扩增病毒基因组
            4.2.1.1 引物设计
            4.2.1.2 RT-PCR实验步骤
            4.2.1.3 核酸电泳实验
        4.2.2 RNA-FISH实验
        4.2.3 复制子转移试验
            4.2.3.1 亚基因组复制子的结构
            4.2.3.2 利用酶切位点将质粒线性化
            4.2.3.3 回收质粒模板
            4.2.3.4 复制子RNA的体外转录
            4.2.3.5 复制子RNA转染细胞
            4.2.3.6 SGR-exosome孵育细胞
    4.3 实验结果
        4.3.1 外泌体样品中可以扩增到病毒的基因组全长
        4.3.2 病毒RNA可以与外泌体标志蛋白共定位
        4.3.3 外泌体携带病毒RNA传播是结构蛋白非依赖性的
    4.4 讨论
第五章 外泌体对中和抗体的逃避作用
    5.1 实验材料
        5.1.1 主要实验试剂与材料
        5.1.2 主要仪器及设备
    5.2 实验方法
        5.2.1 中和抗体与外泌体与口蹄疫病毒作用
        5.2.2 噬斑实验
        5.2.3 中和抗体存在条件下FMDV的传播
        5.2.4 TCID_50的测定
    5.3 实验结果
        5.3.1 噬斑实验结果
        5.3.2 中和抗体不能阻断外泌体介导的FMDV传播
    5.4 讨论
第六章 全文结论
参考文献
致谢
作者简历


【参考文献】：
期刊论文
[1]猪黑色素瘤分化相关基因5（MDA5）对口蹄疫病毒感染宿主的影响[J]. 常兴妮,崔晓蕊,孙鹏,马凯凯,胡高维,杨建设,丁艳平,李志勇.  中国兽医学报. 2017(06)
[2]我国口蹄疫流行现状与控制策略[J]. 何继军,郭建宏,刘湘涛.  中国动物检疫. 2015(06)
[3]负载重组口蹄疫病毒VP4蛋白的树突状细胞启动的T细胞应答[J]. 安鹏丽,李娜,李丽敏,张丽,张雷,高云欢,王家鑫.  畜牧兽医学报. 2012(10)



本文编号：3183068