猪胞内劳森氏菌抗原候选蛋白的原核表达及间接ELISA检测方法的建立与初步应用

发布时间：2021-05-17 23:31

　　本研究以胞内劳森氏菌阳性猪回肠粘膜DNA为模板,通过PCR和Nested-PCR的方法扩增出胞内劳森氏菌四个抗原候选蛋白（即外膜蛋白OMP1022、外膜蛋白OMP0902、外膜蛋白OMP1024和表面脂蛋白SLP0235）的基因序列,并分别构建T-A克隆质粒,再亚克隆到原核表达载体pET-32a（+）中得到原核表达质粒pET32a-OMP1022、pET32a-OMP0902、 pET32a-OMP1024和pET32a-SLP0235,酶切鉴定及序列测定表明,重组表达质粒构建正确。将原核表达质粒pET32a-OMP1022、pET32a-OMP0902、 pET32a-OMP1024和pET32a-SLP0235转入宿主表达菌BL-21（DE3）中,IPTG诱导表达,重组蛋白1022和0902获得表达,而重组蛋白1024和0235末表达或表达量过低。分两段扩增OMP1024,得到1024a和1024b,并构建得到原核表达质粒pET32a-OMP1024a和pET32a-OMP1024b,转入宿主表达菌BL-21（DE3）中,经IPTG诱导后均得到表达。Western-blot证实重组... 

【文章来源】：广西大学广西壮族自治区 211工程院校

【文章页数】：97 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
目录
第一部分 综述
    1.1 胞内劳森氏菌病原学
        1.1.1 胞内菌形态学与分类
        1.1.2 培养
        1.1.3 流行病学
    1.2 致病性
    1.3 病理变化
    1.4 致病机理
    1.5 免疫反应
    1.6 诊断
        1.6.1 临床诊断
        1.6.2 剖检诊断
        1.6.3 活体诊断
    1.7 预防与控制
        1.7.1 抗菌药物
        1.7.2 疫苗免疫
    1.8 目的与意义
    1.9 研究线路
第二部分 实验研究
    研究一 猪胞内劳森氏菌抗原候选蛋白的原核表达及重组蛋白的纯化与复性
        1 主要材料、试剂与仪器
            1.1 材料、菌种及载体
            1.2 主要试剂
            1.3 主要仪器设备
            1.4 引物合成与序列测定
            1.5 主要试剂和培养基的配制
        2 实验方法与步骤
            2.1 抗原候选蛋白的筛选
            2.2 引物
            2.3 DNA的抽提
            2.4 PCR扩增与目的基因回收
            2.5 目的基因克隆
            2.6 原核表达载体的构建
            2.7 重组表达质粒转化表达宿主菌
            2.8 诱导表达及鉴定
            2.9 重组蛋白的纯化及复性
        3. 结果
            3.1 猪胞内劳森氏菌的诊断
            3.2 抗原候选蛋白原核表达载体的构建
            3.3 重组蛋白的表达与鉴定
            3.4 重组蛋白的纯化与复性
        4. 讨论
            4.1 间接ELISA检测方法建立意义
            4.2 胞内劳森氏菌外膜蛋白的抗原性
            4.3 抗原候选蛋白的选择
            4.4 原核表达系统的选择
            4.5 原核表达质粒的构建
            4.6 重组蛋白的表达形式
            4.7 重组蛋白的获得
            4.8 包被抗原的确定
        5. 小结
    研究二 猪胞内劳森氏菌间接ELSIA检测方法的建立及初步应用
        1. 材料、试剂与仪器
            1.1 主要试剂
            1.2 主要仪器
        2. 方法与步骤
            2.1 间接ELISA的基本步骤
            2.2 间接ELlSA的优化
            2.3 间接ELISA阴阳性临界值
            2.4 LI-1024b-ELSIA特异性实验
            2.5 重复性试验
            2.6 LI-1024b间接ELISA检测方法的初步应用
        3 结果
            3.1 ELISA反应条件的优化结果
            3.2 LI-1024b间接ELISA阴阳性临界值的确定
            3.3 LI-1024b-ELSIA特异性试验
            3.4 重复性试验
            3.5 临床样品的检测
        4. 讨论
            4.1 间接ELISA的优点
            4.2 间接ELISA反应条件的优化
            4.3 LI-1024b间接ELISA的特异性
            4.4 临床血清样品检测结果
        5. 小结
第三部分 全文结论
参考文献
附录：英文缩写对照表
致谢
攻读硕士期间发表论文情况



本文编号：3192664