SARS-CoV刺突蛋白嵌合型重组VSV的构建与免疫原性研究
发布时间：2021-05-19 03:40
重症急性呼吸综合征（Severe acute respiratory syndrome,SARS）是由重症急性呼吸综合征病毒（Severe acute respiratory syndrome coronavirus,SARS-CoV）引起的一种急性,发热,并伴有呼吸道感染等严重并发症的致死性传染病。该病传播速度快、死亡率高,且尚无有效的抗病毒药物和商业化疫苗。虽然从2004年以来没有新的SARS感染病例报道,但是该病仍然有再次流行的可能,进而严重威胁民众的健康。2019年12月我国湖北省武汉市爆发了由SARS-CoV-2引起的COVID-19疫情,研究表明该病毒是一种类SARS样新型冠状病毒,说明SARS-CoV依然存在突破物种屏障并通过中间宿主传染给人类的潜在危险,因此研发SARS-CoV储备型疫苗对我国防控SARS具有十分重要的意义。SARS-CoV是冠状病毒科（Coronaviridae）、β-冠状病毒属（β-Coronavirus）成员。刺突蛋白（Spike protein,S）是SARS-CoV的跨膜糖蛋白,主要负责与细胞受体结合、诱导病毒与细胞融合以及刺激机体产生免疫应答...
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：57 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
abstract
英文缩略表
第一章 绪论
1.1 重症急性呼吸综合征的研究进展
1.1.1 重症急性呼吸综合征的病原学
1.1.2 重症急性呼吸综合征的流行病学
1.1.3 重症急性呼吸综合征的临床表现
1.1.4 重症急性呼吸综合征的发病机制
1.1.5 重症急性呼吸综合征的诊断与防控
1.2 重症急性呼吸综合征病毒的分子生物学特性
1.2.1 SARS-Co V概述
1.2.2 SARS-Co V S蛋白的结构功能特点
1.3 重症急性呼吸综合征病毒疫苗研究进展
1.3.1 灭活病毒疫苗
1.3.2 减毒活疫苗
1.3.3 DNA疫苗
1.3.4 亚单位疫苗
1.3.5 重组病毒载体疫苗
1.4 水泡性口炎病毒
1.4.1 水泡性口炎病毒概述
1.4.2 水泡性口炎病毒的形态和基因组结构
1.4.3 水泡性口炎的症状和流行病学
1.4.4 水泡性口炎病毒作为活病毒疫苗载体
1.5 本研究的目的与意义
第二章 表达SARS-Co V S蛋白嵌合型重组VSV的构建与鉴定
2.1 材料
2.1.1 病毒、细胞和血清
2.1.2 质粒
2.1.3 主要实验试剂和仪器
2.2 方法
2.2.1 表达SARS-Co V S蛋白嵌合型重组VSV全长c DNA的构建
2.2.1.1 引物设计与SARS-Co V S蛋白片段合成
2.2.1.2 SARS-Co V S蛋白基因的扩增和序列分析
2.2.1.3 表达S蛋白的嵌合型重组VSV基因组全长c DNA的构建
2.2.1.4 表达e GFP重组S蛋白嵌合型VSV基因组全长c DNA的构建
2.2.2 两种重组病毒的拯救
2.2.3 两种重组病毒的鉴定
2.2.3.1 RT-PCR鉴定
2.2.3.2 S蛋白在感染细胞中的表达
2.2.3.3 S蛋白的激光共聚焦鉴定
2.2.3.4 IFA研究重组病毒的入侵细胞方式
2.2.3.5 重组病毒的形态及S蛋白在病毒颗粒表面的分布
2.2.4 病毒的体外生长动力学曲线检测
2.3 结果
2.3.1 表达S蛋白嵌合型重组VSV基因组全长c DNA的构建
2.3.2 表达e GFP重组S蛋白嵌合型VSV基因组全长c DNA的构建
2.3.3 两种重组病毒的拯救
2.3.4 两种重组病毒的鉴定
2.3.4.1 RT-PCR
2.3.4.2 Western blot验证S蛋白在感染细胞中的表达
2.3.4.3 S蛋白的激光共聚焦
2.3.4.4 IFA研究重组病毒的入侵细胞方式
2.3.4.5 重组病毒的形态特征及S蛋白在病毒颗粒表面的分布
2.3.5 病毒的体外生长动力学曲线检测
2.4 讨论
第三章 动物免疫试验
3.1 材料
3.1.1 病毒、细胞、质粒和实验动物
3.1.2 主要实验试剂和仪器
3.1.3 多肽的合成
3.2 方法
3.2.1 小鼠的免疫试验
3.2.1.1 小鼠的安全性试验
3.2.1.2 小鼠的免疫试验
3.2.1.3 小鼠血清的中和抗体测定
3.2.1.4 小鼠血清ELISA实验
3.2.2 恒河猴免疫试验
3.2.2.1 恒河猴血清的中和抗体测定
3.2.2.2 恒河猴血清ELISA实验
3.2.2.3 PBMCs的分离
3.2.2.4 ELISPOT实验
3.3 结果
3.3.1 VSVΔG-SARS对小鼠的安全性
3.3.2 VSVΔG-SARS诱导小鼠中和抗体效价测定
3.3.3 VSVΔG-SARS诱导小鼠血清Ig G水平测定
3.3.4 VSVΔG-SARS诱导恒河猴中和抗体效价测定
3.3.5 VSVΔG-SARS诱导恒河猴血清Ig G水平测定
3.3.6 CTL细胞表位肽筛选分析
3.4 讨论
第四章 全文结论
参考文献
附录
致谢
作者简历
【参考文献】：
期刊论文
[1]Identification of potential cross-protective epitope between a new type of coronavirus（2019-nCoV） and severe acute respiratory syndrome virus[J]. Tianyi Qiu,Tiantian Mao,Yuan Wang,Mengdi Zhou,Jingxuan Qiu,Jianwei Wang,Jianqing Xu,Zhiwei Cao. Journal of Genetics and Genomics. 2020(02)
[2]Evolution of the novel coronavirus from the ongoing Wuhan outbreak and modeling of its spike protein for risk of human transmission[J]. Xintian Xu,Ping Chen,Jingfang Wang,Jiannan Feng,Hui Zhou,Xuan Li,Wu Zhong,Pei Hao. Science China（Life Sciences）. 2020(03)
[3]表达增强绿色荧光蛋白重组水疱性口炎病毒印第安纳株的构建[J]. 温志远,葛金英,胡森,王永,步志高. 中国预防兽医学报. 2007(12)
[4]水泡性口炎病毒印第安纳株反基因操作系统的建立[J]. 温志远,葛金英,王永,胡森,郝永清,步志高. 中国预防兽医学报. 2006(05)
[5]Bioinformatics analysis of SARS-Cov M protein provides information for vaccine development[J]. LIU Wanli, LU Yun and CHEN Yinghua(Laboratory of Immunology, Research Centre for Medical Science and Department of Biology, Tsinghua University; Protein Science Laboratory of MOE, Beijing 100084, China). Progress in Natural Science. 2003(11)
[6]免疫细胞在SARS病变组织中的表达及其作用[J]. 贺莉,丁彦青,王蔚,张庆玲,张进华,耿舰,蔡俊杰,王慧君. 第一军医大学学报. 2003(08)
[7]93例传染性非典型肺炎患者外周血T淋巴细胞亚群变化及临床意义[J]. 尹炽标,张复春,唐小平,陈伟烈,陈燕清,王健,贾卫东. 中华结核和呼吸杂志. 2003(06)
硕士论文
[1]莱斯顿型埃博拉病毒GP蛋白嵌合型水泡性口炎病毒的构建与免疫原性研究[D]. 祖述龙.中国农业科学院 2016
[2]埃博拉和马尔堡病毒囊膜糖蛋白嵌合型重组水泡性口炎病毒的构建与免疫原性研究[D]. 邵钰.中国农业科学院 2016
[3]表达扎伊尔型埃博拉病毒囊膜糖蛋白重组水泡性口炎病毒的构建[D]. 宋坤.中国农业科学院 2013
本文编号：3195043
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：57 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
abstract
英文缩略表
第一章 绪论
1.1 重症急性呼吸综合征的研究进展
1.1.1 重症急性呼吸综合征的病原学
1.1.2 重症急性呼吸综合征的流行病学
1.1.3 重症急性呼吸综合征的临床表现
1.1.4 重症急性呼吸综合征的发病机制
1.1.5 重症急性呼吸综合征的诊断与防控
1.2 重症急性呼吸综合征病毒的分子生物学特性
1.2.1 SARS-Co V概述
1.2.2 SARS-Co V S蛋白的结构功能特点
1.3 重症急性呼吸综合征病毒疫苗研究进展
1.3.1 灭活病毒疫苗
1.3.2 减毒活疫苗
1.3.3 DNA疫苗
1.3.4 亚单位疫苗
1.3.5 重组病毒载体疫苗
1.4 水泡性口炎病毒
1.4.1 水泡性口炎病毒概述
1.4.2 水泡性口炎病毒的形态和基因组结构
1.4.3 水泡性口炎的症状和流行病学
1.4.4 水泡性口炎病毒作为活病毒疫苗载体
1.5 本研究的目的与意义
第二章 表达SARS-Co V S蛋白嵌合型重组VSV的构建与鉴定
2.1 材料
2.1.1 病毒、细胞和血清
2.1.2 质粒
2.1.3 主要实验试剂和仪器
2.2 方法
2.2.1 表达SARS-Co V S蛋白嵌合型重组VSV全长c DNA的构建
2.2.1.1 引物设计与SARS-Co V S蛋白片段合成
2.2.1.2 SARS-Co V S蛋白基因的扩增和序列分析
2.2.1.3 表达S蛋白的嵌合型重组VSV基因组全长c DNA的构建
2.2.1.4 表达e GFP重组S蛋白嵌合型VSV基因组全长c DNA的构建
2.2.2 两种重组病毒的拯救
2.2.3 两种重组病毒的鉴定
2.2.3.1 RT-PCR鉴定
2.2.3.2 S蛋白在感染细胞中的表达
2.2.3.3 S蛋白的激光共聚焦鉴定
2.2.3.4 IFA研究重组病毒的入侵细胞方式
2.2.3.5 重组病毒的形态及S蛋白在病毒颗粒表面的分布
2.2.4 病毒的体外生长动力学曲线检测
2.3 结果
2.3.1 表达S蛋白嵌合型重组VSV基因组全长c DNA的构建
2.3.2 表达e GFP重组S蛋白嵌合型VSV基因组全长c DNA的构建
2.3.3 两种重组病毒的拯救
2.3.4 两种重组病毒的鉴定
2.3.4.1 RT-PCR
2.3.4.2 Western blot验证S蛋白在感染细胞中的表达
2.3.4.3 S蛋白的激光共聚焦
2.3.4.4 IFA研究重组病毒的入侵细胞方式
2.3.4.5 重组病毒的形态特征及S蛋白在病毒颗粒表面的分布
2.3.5 病毒的体外生长动力学曲线检测
2.4 讨论
第三章 动物免疫试验
3.1 材料
3.1.1 病毒、细胞、质粒和实验动物
3.1.2 主要实验试剂和仪器
3.1.3 多肽的合成
3.2 方法
3.2.1 小鼠的免疫试验
3.2.1.1 小鼠的安全性试验
3.2.1.2 小鼠的免疫试验
3.2.1.3 小鼠血清的中和抗体测定
3.2.1.4 小鼠血清ELISA实验
3.2.2 恒河猴免疫试验
3.2.2.1 恒河猴血清的中和抗体测定
3.2.2.2 恒河猴血清ELISA实验
3.2.2.3 PBMCs的分离
3.2.2.4 ELISPOT实验
3.3 结果
3.3.1 VSVΔG-SARS对小鼠的安全性
3.3.2 VSVΔG-SARS诱导小鼠中和抗体效价测定
3.3.3 VSVΔG-SARS诱导小鼠血清Ig G水平测定
3.3.4 VSVΔG-SARS诱导恒河猴中和抗体效价测定
3.3.5 VSVΔG-SARS诱导恒河猴血清Ig G水平测定
3.3.6 CTL细胞表位肽筛选分析
3.4 讨论
第四章 全文结论
参考文献
附录
致谢
作者简历
【参考文献】：
期刊论文
[1]Identification of potential cross-protective epitope between a new type of coronavirus（2019-nCoV） and severe acute respiratory syndrome virus[J]. Tianyi Qiu,Tiantian Mao,Yuan Wang,Mengdi Zhou,Jingxuan Qiu,Jianwei Wang,Jianqing Xu,Zhiwei Cao. Journal of Genetics and Genomics. 2020(02)
[2]Evolution of the novel coronavirus from the ongoing Wuhan outbreak and modeling of its spike protein for risk of human transmission[J]. Xintian Xu,Ping Chen,Jingfang Wang,Jiannan Feng,Hui Zhou,Xuan Li,Wu Zhong,Pei Hao. Science China（Life Sciences）. 2020(03)
[3]表达增强绿色荧光蛋白重组水疱性口炎病毒印第安纳株的构建[J]. 温志远,葛金英,胡森,王永,步志高. 中国预防兽医学报. 2007(12)
[4]水泡性口炎病毒印第安纳株反基因操作系统的建立[J]. 温志远,葛金英,王永,胡森,郝永清,步志高. 中国预防兽医学报. 2006(05)
[5]Bioinformatics analysis of SARS-Cov M protein provides information for vaccine development[J]. LIU Wanli, LU Yun and CHEN Yinghua(Laboratory of Immunology, Research Centre for Medical Science and Department of Biology, Tsinghua University; Protein Science Laboratory of MOE, Beijing 100084, China). Progress in Natural Science. 2003(11)
[6]免疫细胞在SARS病变组织中的表达及其作用[J]. 贺莉,丁彦青,王蔚,张庆玲,张进华,耿舰,蔡俊杰,王慧君. 第一军医大学学报. 2003(08)
[7]93例传染性非典型肺炎患者外周血T淋巴细胞亚群变化及临床意义[J]. 尹炽标,张复春,唐小平,陈伟烈,陈燕清,王健,贾卫东. 中华结核和呼吸杂志. 2003(06)
硕士论文
[1]莱斯顿型埃博拉病毒GP蛋白嵌合型水泡性口炎病毒的构建与免疫原性研究[D]. 祖述龙.中国农业科学院 2016
[2]埃博拉和马尔堡病毒囊膜糖蛋白嵌合型重组水泡性口炎病毒的构建与免疫原性研究[D]. 邵钰.中国农业科学院 2016
[3]表达扎伊尔型埃博拉病毒囊膜糖蛋白重组水泡性口炎病毒的构建[D]. 宋坤.中国农业科学院 2013
本文编号：3195043
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