小反刍兽疫病毒囊膜糖蛋白和受体的相互作用研究

发布时间：2017-04-23 00:02

  本文关键词：小反刍兽疫病毒囊膜糖蛋白和受体的相互作用研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：小反刍兽疫(PPR)是由小反刍兽疫病毒(PPRV)引起野生和家养小反刍动物的一种急性、高度传染性病毒病,是世界动物卫生组织法定必须报告的动物疫病。PPRV是副粘病毒科麻疹病毒属的成员,是一种囊膜病毒。一般来说,病毒通过识别、结合特异性受体进而侵入宿主细胞。副粘病毒在侵入细胞的过程中通过两种囊膜糖蛋白——血凝素蛋白H和融合蛋白F,它们介导病毒囊膜和宿主细胞膜的融合过程。麻疹病毒属病毒血凝素蛋白H的主要作用是与宿主细胞膜受体发生结合,调节病毒吸附并侵入宿主细胞,是决定病毒能否感染的关键因素;F蛋白作为融合的直接作用蛋白,是决定副粘病毒毒力的主要因素,它不仅直接参与病毒囊膜与宿主细胞膜的融合,而且也可以介导宿主临近细胞间的融合。HR1和HR2是F基因中的两段保守序列,对病毒囊膜和宿主细胞膜的融合有重要的意义。现已确定的PPRV的天然受体有两个:信号淋巴激活分子(SLAM)和脊髓灰质炎病毒受体(Nectin4/PVRL4),同时这两种受体也是麻疹病毒和犬瘟热病毒等的受体。本研究做了以下工作:(一)PPRV囊膜糖蛋白基因和受体基因的真核表达。构建SLAM、HR1和HR2真核表达重组质粒pCMV-Myc-SLAM、pCMV-HA-HR1和pCMV-HA-HR2,提取本实验室保存的)疫苗株血凝素蛋白(Hv)、野毒株血凝素蛋白(Hw)、脊髓灰质炎病毒受体4(Nectin4)和融合蛋白(F)的重组质粒pCMV-HA-Hv、pCMV-HA-Hw、pCMV-Myc-Nectin4、pCAGGS-Flag-F,所有质粒均分别转染CHO细胞,通过间接免疫荧光(IF)、流式细胞术(FCM)和Western-blot分析蛋白的表达。Western-blot分析所表达的目的蛋白大小与预期大小一致;IF结果显示转染pCMV-HA-Hv、pCMV-HA-Hw、pCMV-HA-HR1和pCMV-HA-HR2质粒的CHO细胞出现绿色荧光,转染pCMV-Myc-SLAM和pCMV-Myc-Nectin4质粒的CHO细胞出现红色荧光,转染pCAGGS-Flag-F质粒的CHO细胞出现蓝色荧光,说明目的蛋白与载体的标签蛋白融合表达;FCM结果显示用抗标签蛋白的单抗作一抗,间接免疫荧光标记目的蛋白的阳性率高于同型对照的阳性率,说明重组质粒均在CHO细胞中大量表达。(二)PPRV表面糖蛋白H、F与受体之间的互作分析。将SLAM(或Nectin4)重组质粒分别与Hv、Hw、HR1和HR2共转染CHO细胞,IF结果表明受体SLAM、Nectin4与Hv、Hw、HR1和HR2在细胞质内共表达,并且蛋白发生了共定位;Co-IP结果表明受体SLAM、Nectin4分别可以沉淀Hv、Hw、HR1和HR2蛋白,同时Hv、Hw、HR1和HR2蛋白也可以沉淀受体SLAM、Nectin4,说明SLAM(或Nectin4)分别可以和Hv、Hw、HR1及HR2相互作用。纯化重组蛋白,用表面等离子共振分析粘附蛋白H分别与受体SLAM和Nectin4及F蛋白、HR1、HR2间的结合力。结果显示,Hv和Hw蛋白最合适的偶联缓冲液均为pH5.0的10mM乙酸钠,偶联量分别为6438.7和7881.7RU;Hv和Hw与F、HR1、HR2、SLAM、Nectin4间均存在相互作用力,除HR1外,Hv与其余蛋白均具有高结合力,平衡解离常数KD介于1.3×10-10~3.87×10-8之间;Hw与SALM的结合力最小,平衡解离常数KD仅为1.21×10-5,与其余蛋白均具有高结合力,平衡解离常数KD介于7.1×10-12~5.97×10-8之间。(三)PPRV表面糖蛋白H和F的促细胞融合作用分析。将SLAM(或Nectin4)的重组质粒与H和F重组质粒共转染于CHO细胞,36 h后用普通光学显微镜分析受体和两种囊膜蛋白的相互作用对细胞融合的影响,用共聚焦显微镜分析蛋白的定位。通过光学显微镜观察到受体SLAM或Nectin4与融合蛋白以及粘附蛋白H共表达可以引起细胞融合,此外共表达受体蛋白和融合蛋白F也可以引起细胞融合。共聚焦显微镜观察到同时转染受体SLAM(或Nectin4)、H和F质粒,三种蛋白共表达,蛋白分布出现了极化现象并且不同蛋白分布发生了共定位。
【关键词】：小反刍兽疫病毒 粘附蛋白 融合蛋白 天然受体 相互作用
【学位授予单位】：甘肃农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.65
【目录】：

• 摘要3-5
• Summary5-7
• 英文缩略表7-11
• 第一篇 综述11-30
• 1 PPRV研究进展12-19
• 1.1 PPRV分子病原学特点12-13
• 1.1.1 病毒理化特性12
• 1.1.2 病毒粒子结构12
• 1.1.3 基因组结构12-13
• 1.2 病毒的复制13-16
• 1.2.1 吸附和侵入13-15
• 1.2.2 转录和复制15-16
• 1.2.3 病毒的组装和释放16
• 1.3 致病机理16-18
• 1.4 易感动物和对PPRV的抵抗力18-19
• 2 副粘病毒属的融合机制19-30
• 2.1 H蛋白的结构和在激活融合中的作用19-22
• 2.2 F蛋白的结构和在激活融合中的作用22-23
• 2.3 MV-H与受体SLAM和Nectin4的相互作用机制23-30
• 2.3.1 MV-H和SLAM的相互作用23-27
• 2.3.2 MV-H和Nectin4的相互作用27
• 2.3.3 MV-H和与这三个受体之间结合的比较27-30
• 第二篇 试验部分30-64
• 第一章 PPRV囊膜糖蛋白基因和受体基因的真核表达30-45
• 1 材料与方法31-38
• 1.1 毒株?载体和菌种31
• 1.2 试剂及酶31
• 1.3 培养基及溶液31-32
• 1.4 SLAM蛋白基因真核表达载体构建32-35
• 1.4.1 SLAM蛋白基因引物的设计32
• 1.4.2 SLAM蛋白基因的PCR扩增32-33
• 1.4.3 SLAM蛋白基因PCR产物的纯化33
• 1.4.4 p CMV-Myc载体质粒的提取33-34
• 1.4.5 目的片段与载体的双酶切及回收34
• 1.4.6 重组质粒的连接34
• 1.4.7 连接产物的转化、重组质粒阳性克隆的筛选和鉴定34-35
• 1.5 F蛋白七肽重复区基因真核表达载体的构建35-36
• 1.5.1 HR1和HR2蛋白基因引物的设计35
• 1.5.2 HR1和HR2蛋白基因的PCR扩增35-36
• 1.6 重组质粒的真核表达与检测36-38
• 1.6.1 重组质粒转染CHO细胞36
• 1.6.2 间接免疫荧光检测检测重组质粒在CHO细胞中的表达36-37
• 1.6.3 流式细胞术检测重组质粒在CHO细胞中的表达37-38
• 1.6.4 Western blotting检测重组质粒在CHO细胞中的表达38
• 2 结果38-43
• 2.1 重组表达质粒的构建与鉴定38-41
• 2.1.1 SLAM重组表达质粒的构建与鉴定38
• 2.1.2 HR1和HR2重组表达质粒的构建与鉴定38-40
• 2.1.3 间接免疫荧光法检测重组真核表达质粒的表达40-41
• 2.2 流式细胞术（FCM）检测重组真核表达质粒的表达41-43
• 2.3 重组质粒表达蛋白的Western blotting检测43
• 3 讨论43-45
• 第二章 PPRV表面糖蛋白和受体蛋白之间的相互作用45-58
• 1 材料与方法46-48
• 1.1 试剂及仪器46
• 1.2 间接免疫荧光检测蛋白表达和定位46-47
• 1.3 Co-IP检测蛋白之间的相互作用47
• 1.4 表面等离子共振（SPR）检测蛋白之间的相互作用47-48
• 2 结果48-57
• 2.1 共聚焦显示共转染质粒在CHO细胞中共表达且共定位于同一层面48-49
• 2.2 免疫共沉淀显示共转染的两种质粒共表达且蛋白有相互作用49-52
• 2.3 SPR表明粘附蛋白H与两种受体和融合蛋白都有相互作用52-57
• 3 讨论57-58
• 第三章 PPRV表面糖蛋白H和F的促融合作用研究58-64
• 1 材料和方法58-59
• 1.1 材料58-59
• 1.2 转染CHO细胞59
• 1.3 免疫荧光检测蛋白表达和细胞融合试验59
• 1.4 激光共聚焦观察极化现象59
• 2 结果59-63
• 2.1 F和受体Sl AM可以促进细胞融合59-60
• 2.2 H和F蛋白在细胞中发生共定位60-63
• 3 讨论63-64
• 结论64-65
• 参考文献65-71
• 致谢71-72
• 个人简介72-73
• 导师简介73-74

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本文编号：321481