单个B淋巴细胞的抗病毒抗体的筛选与鉴定
发布时间：2021-06-09 04:43
抗体作为机体获得性免疫的重要工具,在体液免疫反应中占有重要地位。由于其特异性与有效性,因此人们不断尝试通过各种体外表达技术获得抗体,用于病毒病的研究与防治。从多克隆抗体制备技术到杂交瘤细胞技术,再到基因工程抗体制备技术的发展中,人们发现抗体制备仍然面临着难度大、耗时长、异源性反应等问题。基于此,近年来发展出从一种单个B淋巴细胞制备抗体的新兴技术,该方法依赖于流式分选技术,能够在单个B淋巴细胞中分离表达出大量天然构象的特异性抗体。本研究利用基于单个B淋巴细胞制备单克隆抗体技术,分别开展抗O型FMDV抗体、抗CPV抗体与抗RABV人源抗体的制备与鉴定。在健康C57BL/6小鼠脾脏悬浮液中,利用泛B细胞表面标记CD19的磁珠富集B细胞后,采用流式分选技术经过B220+/IgG1+/CD38+/O型FMDV抗原+分选,以19/500000的比例获得单个抗原特异性B细胞,随后利用单细胞反转录-巢式PCR反应,扩增获得8个抗体轻链可变区完整基因片段与19个抗体重链可变区完整基因片段,阳性比例分别为33.3%与7...
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：70 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
A抗体的结构
中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言第一章 引 言1.1 抗体1.1.1 抗体的结构抗体作为一种免疫球蛋白（Immunoglobulin, Ig），其结构是由两条重链（H 链）和两条轻链（L 链）构成，并分别含有各自的恒定区（Constant region, C 区）和可变区（Variable region, V 区）；轻链较短，分子量约为 25 kD，大约由 210 个氨基酸组成，重链相对较长，分子量约为 55 kD，由 450-550 个氨基酸组成，其中包含有一个 V 区和 3-4 个 C 区，同时他们相互之间由半胱氨酸残基形成的二硫键连接（Wade et al., 1997）。用木瓜蛋白酶消化后可得到两个相同的 Fab 片段与一个 Fc 片段(图 1.1A)。C 区氨基酸序列基本保持不变，其主要功能是提供效应细胞的结合位点，激活补体，提供转运位点等；V 区氨基酸序列变化较大，根据氨基酸变异程度又分为三个高变区（complementarity determining region, CDR）与四个骨架区（framework region, FR）（Schroeder eal., 2010）(图 1.1B)。
分选技术（Magnetic activated cell sorting, MACS）是一种通过磁株标记能够有活性且功能活跃的细胞的方法（图 1.5）。MACS 由 MACS 磁珠、MAC组成，当 MACS 柱被放置在 MACS 分离器(强永磁体)中时，在柱基质中诱其强度足以保留标记有最低数量 MACS 磁珠的细胞，未标记的细胞则会通过取下 MACS 柱后，被标记的细胞就会释放出来。因此，利用 MACS 技术，组分都可以很容易地分离出来并得到高纯度的细胞。整个过程不超过 30min进行后续试验(Dainiak et al., 2007)。MACS 技术的标记可分为直接标记和间可分为正向分选与负向分选。荧光染色偶联 MACS 抗体可同时用于流式细胞、分离细胞组分。目前 MACS 技术已经成为细胞分离的标准方法，适用于各个室到临床应用，从小型试验到大型试验操作，从常见细胞类型到罕见细胞和量分离，MACS 技术均被广泛应用(Thelen et al., 2017)。图 1.4 流式细胞荧光分选法Fig 1.4 The technology of FACS
本文编号：3219956
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：70 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
A抗体的结构
中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言第一章 引 言1.1 抗体1.1.1 抗体的结构抗体作为一种免疫球蛋白（Immunoglobulin, Ig），其结构是由两条重链（H 链）和两条轻链（L 链）构成，并分别含有各自的恒定区（Constant region, C 区）和可变区（Variable region, V 区）；轻链较短，分子量约为 25 kD，大约由 210 个氨基酸组成，重链相对较长，分子量约为 55 kD，由 450-550 个氨基酸组成，其中包含有一个 V 区和 3-4 个 C 区，同时他们相互之间由半胱氨酸残基形成的二硫键连接（Wade et al., 1997）。用木瓜蛋白酶消化后可得到两个相同的 Fab 片段与一个 Fc 片段(图 1.1A)。C 区氨基酸序列基本保持不变，其主要功能是提供效应细胞的结合位点，激活补体，提供转运位点等；V 区氨基酸序列变化较大，根据氨基酸变异程度又分为三个高变区（complementarity determining region, CDR）与四个骨架区（framework region, FR）（Schroeder eal., 2010）(图 1.1B)。
分选技术（Magnetic activated cell sorting, MACS）是一种通过磁株标记能够有活性且功能活跃的细胞的方法（图 1.5）。MACS 由 MACS 磁珠、MAC组成，当 MACS 柱被放置在 MACS 分离器(强永磁体)中时，在柱基质中诱其强度足以保留标记有最低数量 MACS 磁珠的细胞，未标记的细胞则会通过取下 MACS 柱后，被标记的细胞就会释放出来。因此，利用 MACS 技术，组分都可以很容易地分离出来并得到高纯度的细胞。整个过程不超过 30min进行后续试验(Dainiak et al., 2007)。MACS 技术的标记可分为直接标记和间可分为正向分选与负向分选。荧光染色偶联 MACS 抗体可同时用于流式细胞、分离细胞组分。目前 MACS 技术已经成为细胞分离的标准方法，适用于各个室到临床应用，从小型试验到大型试验操作，从常见细胞类型到罕见细胞和量分离，MACS 技术均被广泛应用(Thelen et al., 2017)。图 1.4 流式细胞荧光分选法Fig 1.4 The technology of FACS
本文编号：3219956
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