乙型脑炎病毒NS5和E蛋白单抗的制备及其特性分析
发布时间：2021-07-25 23:44
乙型脑炎（Japanese encephalitis, JE）是由乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus,JEV）引起的一种危害严重的虫媒性人畜共患病。JEV主要是通过猪和蚊子进行传播,感染后主要引起母猪流产、死胎以及公猪的睾丸炎,不仅对养猪业造成很大的损失,同时也严重威胁人类的健康。本研究用原核表达的NS5蛋白和纯化的JEV分别免疫小鼠,经过细胞融合筛选到了6株特异性的JEVNS5蛋白单抗和5株E蛋白单抗,并对这些单抗的生物学特性进行了验证,具体研究内容如下：1. JEV NS5蛋白单克隆抗体的制备及其靶抗原表位的研究利用原核表达的JEV NS5蛋白免疫小鼠,通过细胞融合筛选到了6株特异性的单克隆抗体,分别为：1G6.1F12、2A5、3C4、3H7、3F10,亚型分别为IgG2b、 IgG2a、IgG2b、IgG1、IgG2a和IgG2a,轻链均为Kappa链。经间接免疫荧光（IFA）和Western blot检测,这6株单抗均具有较好的特异性。在此基础上,构建NS5真核分片段表达质粒pCMV-NS5（1-405）,pCMV-NS5（406-905）并...
【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：55 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 文献综述
1.1 乙型脑炎的流行病学
1.1.1 流行特征
1.1.2 易感群体
1.1.3 传播媒介与宿主
1.2 乙型脑炎病毒的生物学特性
1.2.1 乙型脑炎病毒的形态及基因组的结构和功能
1.2.2 乙型脑炎病毒的入侵和合成过程
1.2.3 乙型脑炎病毒的毒株间变异
1.3 乙型脑炎的临床症状和病理变化
1.3.1 乙型脑炎病毒的致病机理
1.3.2 乙型脑炎的病理变化
1.3.3 乙型脑炎的临床症状
1.4 乙型脑炎诊断技术的研究进展
1.4.1 病毒的分离和鉴定
1.4.2 免疫学诊断
1.5 研究目的与意义
第二章 日本乙型脑炎病毒NS5蛋白单克隆抗体的制备及其特性分析
2.1 实验材料
2.1.1 质粒、菌株、细胞系和实验动物
2.1.2 主要药品、试剂和仪器
2.1.3 使用的培养基和其配制方法
2.1.4 缓冲液(溶液)和其配制
2.2 实验方法
2.2.1 蛋白的诱导表达
2.2.2 诱导表达产物的SDS-PAGE分析
2.2.3 免疫原与检测抗原的制备
2.2.4 动物免疫
2.2.5 间接ELISA检测方法的建立
2.2.6 间接ELISA法检测小鼠的免疫效果
2.2.7 SP2/0骨髓瘤细胞的准备
2.2.8 免疫脾细胞的准备
2.2.9 饲养细胞的准备
2.2.10 细胞融合
2.2.11 阳性杂交瘤细胞的筛选
2.2.12 阳性杂交瘤细胞的亚克隆
2.2.13 单克隆抗体的大量制备
2.2.14 单克隆抗体效价的测定
2.2.15 单克隆抗体的亚型鉴定
2.2.16 单克隆抗体的IFA分析
2.2.17 单克隆抗体的Western blot分析
2.2.18 单克隆抗体靶抗原表位区域的分析
2.2.19 JEV不同毒株NS5蛋白氨基酸序列的比对
2.2.20 3C4株单抗靶抗原表位的三维结构分析
2.2.21 多肽的设计和合成
2.2.22 3C4株单抗与合成多肽的反应检测
2.3 结果与分析
2.3.1 NS5蛋白的纯化鉴定
2.3.2 免疫小鼠血清效价的测定
2.3.3 杂交瘤细胞株的筛选
2.3.4 单克隆抗体效价的测定
2.3.5 单克隆抗体的亚型鉴定
2.3.6 单克隆抗体的IFA检测
2.3.7 单克隆抗体的Western blot分析
2.3.8 单克隆抗体靶抗原表位区域的分析
2.3.9 3C4株单抗与不同的JEV毒株的反应
2.3.10 JEV SX09S-1株与SA14-14-2株、P3株NS5蛋白氨基酸序列的比对
2.3.11 JEV SX09S-1株与SA14-14-2株、P3株NS5蛋白差异氨基酸
2.3.12 WNV NS5蛋白RdRp区3D结构图
2.3.13 3C4株单抗与多肽的ELISA检测结果
2.3.14 432位氨基酸在NS5蛋白三维结构中的位置
2.4 讨论
2.5 小结
第三章 日本乙型脑炎病毒E蛋白单克隆抗体制备及其特性分析
3.1 实验材料
3.1.1 毒株、细胞系和实验动物
3.1.2 主要药品、试剂和仪器
3.1.3 使用的培养基和其配制方法
3.1.4 缓冲液(溶液)和其配制
3.2 实验方法
3.2.1 病毒的扩增
3.2.2 小鼠免疫
3.2.3 小鼠免疫效果检测
3.2.4 SP2/0骨髓瘤细胞的准备
3.2.5 免疫脾细胞的准备
3.2.6 饲养细胞的准备
3.2.7 细胞融合
3.2.8 阳性株的筛选和亚克隆
3.2.9 单克隆抗体的大量制备
3.2.10 单抗亚型的鉴定
3.2.11 单抗生物学特性的分析
3.2.12 单抗中和活性的检测
3.3 结果与分析
3.3.1 免疫小鼠血清效价的测定
3.3.2 单克隆抗体效价的测定
3.3.3 单克隆抗体的亚型鉴定
3.3.4 单克隆抗体的IFA检测
3.3.5 单克隆抗体的Western blot分析
3.3.6 JEV单抗中和活性的检测
3.4 讨论
3.5 小结
结论
参考文献
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]山西猪源基因Ⅰ型乙型脑炎病毒的分离与鉴定[J]. 曹齐树,钱平,朱巧艳,钱苏红,李静逸,林飞宏,李祥敏,孙艳芳,陈焕春. 中国兽医学报. 2011(05)
[2]检测猪乙型脑炎病毒抗体间接ELISA方法的建立与应用[J]. 沈婷,周斌,陈溥言. 畜牧与兽医. 2010(04)
[3]乙型脑炎病毒研究进展[J]. 赵荣乐,郑光宇. 生物学通报. 2007(07)
[4]猪乙型脑炎研究进展[J]. 邓永,徐高原. 养殖与饲料. 2007(06)
[5]中国2000～2004年流行性乙型脑炎流行病学特征分析[J]. 陈园生,梁晓峰,王晓军,李艺星,杨俊峰,李军宏,尹遵栋,胡苑笙,陆伟. 中国计划免疫. 2006(03)
[6]新型SPA协同凝集试验与血凝抑制试验检测猪乙型脑炎病毒特异性抗体的比较[J]. 宋大伟,魏建超,郑其升,周斌,曹瑞兵,陈溥言. 畜牧与兽医. 2006(06)
[7]1997至2004年贵州省流行性乙型脑炎病例流行病学分析及控制策略[J]. 宋群锋,陶沁,余春,蒋维佳,周敬祝,王昭孝. 中国媒介生物学及控制杂志. 2006(02)
[8]辽宁省乙脑病毒的分离与鉴定[J]. 王俊文,付士红,王环宇,毛晓燕,刘卫滨,何英,孙肖红,蔡增林,吴立平,赵习芳,韩瑞红,景雅,梁国栋. 中华实验和临床病毒学杂志. 2006(01)
[9]黑龙江省部分地区虫媒病毒调查[J]. 王环宇,付士红,王俊文,何英,蔡增林,韩瑞红,刘国平,孙肖红,张强,唐青,梁国栋. 中华实验和临床病毒学杂志. 2005(04)
[10]我国虫媒病毒研究10年回顾[J]. 王环宇,梁国栋. 中国公共卫生. 2003(04)
博士论文
[1]乙型脑炎病毒与树突状细胞的互作研究[D]. 李么明.华中农业大学 2009
[2]乙型脑炎病毒全基因组分子进化及基因重组研究[D]. 潘晓玲.中国疾病预防控制中心 2009
硕士论文
[1]乙型脑炎病毒双抗体夹心ELISA抗原检测方法的建立与应用[D]. 梅力.华中农业大学 2012
[2]日本乙型脑炎实验室诊断方法的研究和应用[D]. 孙圣福.华中农业大学 2004
本文编号：3303007
【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：55 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 文献综述
1.1 乙型脑炎的流行病学
1.1.1 流行特征
1.1.2 易感群体
1.1.3 传播媒介与宿主
1.2 乙型脑炎病毒的生物学特性
1.2.1 乙型脑炎病毒的形态及基因组的结构和功能
1.2.2 乙型脑炎病毒的入侵和合成过程
1.2.3 乙型脑炎病毒的毒株间变异
1.3 乙型脑炎的临床症状和病理变化
1.3.1 乙型脑炎病毒的致病机理
1.3.2 乙型脑炎的病理变化
1.3.3 乙型脑炎的临床症状
1.4 乙型脑炎诊断技术的研究进展
1.4.1 病毒的分离和鉴定
1.4.2 免疫学诊断
1.5 研究目的与意义
第二章 日本乙型脑炎病毒NS5蛋白单克隆抗体的制备及其特性分析
2.1 实验材料
2.1.1 质粒、菌株、细胞系和实验动物
2.1.2 主要药品、试剂和仪器
2.1.3 使用的培养基和其配制方法
2.1.4 缓冲液(溶液)和其配制
2.2 实验方法
2.2.1 蛋白的诱导表达
2.2.2 诱导表达产物的SDS-PAGE分析
2.2.3 免疫原与检测抗原的制备
2.2.4 动物免疫
2.2.5 间接ELISA检测方法的建立
2.2.6 间接ELISA法检测小鼠的免疫效果
2.2.7 SP2/0骨髓瘤细胞的准备
2.2.8 免疫脾细胞的准备
2.2.9 饲养细胞的准备
2.2.10 细胞融合
2.2.11 阳性杂交瘤细胞的筛选
2.2.12 阳性杂交瘤细胞的亚克隆
2.2.13 单克隆抗体的大量制备
2.2.14 单克隆抗体效价的测定
2.2.15 单克隆抗体的亚型鉴定
2.2.16 单克隆抗体的IFA分析
2.2.17 单克隆抗体的Western blot分析
2.2.18 单克隆抗体靶抗原表位区域的分析
2.2.19 JEV不同毒株NS5蛋白氨基酸序列的比对
2.2.20 3C4株单抗靶抗原表位的三维结构分析
2.2.21 多肽的设计和合成
2.2.22 3C4株单抗与合成多肽的反应检测
2.3 结果与分析
2.3.1 NS5蛋白的纯化鉴定
2.3.2 免疫小鼠血清效价的测定
2.3.3 杂交瘤细胞株的筛选
2.3.4 单克隆抗体效价的测定
2.3.5 单克隆抗体的亚型鉴定
2.3.6 单克隆抗体的IFA检测
2.3.7 单克隆抗体的Western blot分析
2.3.8 单克隆抗体靶抗原表位区域的分析
2.3.9 3C4株单抗与不同的JEV毒株的反应
2.3.10 JEV SX09S-1株与SA14-14-2株、P3株NS5蛋白氨基酸序列的比对
2.3.11 JEV SX09S-1株与SA14-14-2株、P3株NS5蛋白差异氨基酸
2.3.12 WNV NS5蛋白RdRp区3D结构图
2.3.13 3C4株单抗与多肽的ELISA检测结果
2.3.14 432位氨基酸在NS5蛋白三维结构中的位置
2.4 讨论
2.5 小结
第三章 日本乙型脑炎病毒E蛋白单克隆抗体制备及其特性分析
3.1 实验材料
3.1.1 毒株、细胞系和实验动物
3.1.2 主要药品、试剂和仪器
3.1.3 使用的培养基和其配制方法
3.1.4 缓冲液(溶液)和其配制
3.2 实验方法
3.2.1 病毒的扩增
3.2.2 小鼠免疫
3.2.3 小鼠免疫效果检测
3.2.4 SP2/0骨髓瘤细胞的准备
3.2.5 免疫脾细胞的准备
3.2.6 饲养细胞的准备
3.2.7 细胞融合
3.2.8 阳性株的筛选和亚克隆
3.2.9 单克隆抗体的大量制备
3.2.10 单抗亚型的鉴定
3.2.11 单抗生物学特性的分析
3.2.12 单抗中和活性的检测
3.3 结果与分析
3.3.1 免疫小鼠血清效价的测定
3.3.2 单克隆抗体效价的测定
3.3.3 单克隆抗体的亚型鉴定
3.3.4 单克隆抗体的IFA检测
3.3.5 单克隆抗体的Western blot分析
3.3.6 JEV单抗中和活性的检测
3.4 讨论
3.5 小结
结论
参考文献
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]山西猪源基因Ⅰ型乙型脑炎病毒的分离与鉴定[J]. 曹齐树,钱平,朱巧艳,钱苏红,李静逸,林飞宏,李祥敏,孙艳芳,陈焕春. 中国兽医学报. 2011(05)
[2]检测猪乙型脑炎病毒抗体间接ELISA方法的建立与应用[J]. 沈婷,周斌,陈溥言. 畜牧与兽医. 2010(04)
[3]乙型脑炎病毒研究进展[J]. 赵荣乐,郑光宇. 生物学通报. 2007(07)
[4]猪乙型脑炎研究进展[J]. 邓永,徐高原. 养殖与饲料. 2007(06)
[5]中国2000～2004年流行性乙型脑炎流行病学特征分析[J]. 陈园生,梁晓峰,王晓军,李艺星,杨俊峰,李军宏,尹遵栋,胡苑笙,陆伟. 中国计划免疫. 2006(03)
[6]新型SPA协同凝集试验与血凝抑制试验检测猪乙型脑炎病毒特异性抗体的比较[J]. 宋大伟,魏建超,郑其升,周斌,曹瑞兵,陈溥言. 畜牧与兽医. 2006(06)
[7]1997至2004年贵州省流行性乙型脑炎病例流行病学分析及控制策略[J]. 宋群锋,陶沁,余春,蒋维佳,周敬祝,王昭孝. 中国媒介生物学及控制杂志. 2006(02)
[8]辽宁省乙脑病毒的分离与鉴定[J]. 王俊文,付士红,王环宇,毛晓燕,刘卫滨,何英,孙肖红,蔡增林,吴立平,赵习芳,韩瑞红,景雅,梁国栋. 中华实验和临床病毒学杂志. 2006(01)
[9]黑龙江省部分地区虫媒病毒调查[J]. 王环宇,付士红,王俊文,何英,蔡增林,韩瑞红,刘国平,孙肖红,张强,唐青,梁国栋. 中华实验和临床病毒学杂志. 2005(04)
[10]我国虫媒病毒研究10年回顾[J]. 王环宇,梁国栋. 中国公共卫生. 2003(04)
博士论文
[1]乙型脑炎病毒与树突状细胞的互作研究[D]. 李么明.华中农业大学 2009
[2]乙型脑炎病毒全基因组分子进化及基因重组研究[D]. 潘晓玲.中国疾病预防控制中心 2009
硕士论文
[1]乙型脑炎病毒双抗体夹心ELISA抗原检测方法的建立与应用[D]. 梅力.华中农业大学 2012
[2]日本乙型脑炎实验室诊断方法的研究和应用[D]. 孙圣福.华中农业大学 2004
本文编号：3303007
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