猪传染性胸膜肺炎血清7型菌株的分离鉴定与体内诱导表达基因的筛选

发布时间：2021-08-09 11:24

　　猪传染性胸膜肺炎（Porcine Contagious Pleuropneumonia, PCP）是由胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae, APP）引起猪的一种高度接触性传染病,该病严重危害世界养猪业的发展,给养猪业带来巨大的经济损失。本研究就其分离鉴定与血清7型菌株体内诱导基因筛选作了以下工作：1.APP的分离鉴定本研究从四川某猪场的疑似猪传染性胸膜肺炎的病猪中分离到一株革兰氏阴性短杆菌。经染色镜检、生化试验、PCR检测、血清型检测和药敏试验等鉴定,结果表明分离株的生化试验结果与多数APP分离株的一致,采用PCR可扩增出约450bp左右的APP特异性目的条带,利用琼脂扩散试验对分离株进行血清型鉴定为7型,药敏试验结果显示该分离株对大多数药物都比较敏感,仅对林可霉素耐药。综合判定该分离株为猪APP的7型菌株。2.APP7基因组表达文库的构建本研究用pET28a/b/c载体构建表达文库。提取APP血清7型的基因组DNA,经Sau3A I经行不完全酶切,回收0.5～2kb的DNA片段。纯化后的DNA片段与经具有相同酶切位点的BamHI单酶切及C... 

【文章来源】：四川农业大学四川省 211工程院校

【文章页数】：71 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
符号说明
第一部分 文献综述
    1 胸膜肺炎放线杆菌概述
        1.1 胸膜肺炎放线杆菌的病原学
        1.2 胸膜肺炎放线杆菌主要毒力因子研究进展
            1.2.1 Apx毒素
            1.2.2 其他毒力因子
        1.3 病原的分离鉴定及诊断
        1.4 猪传染性胸膜肺炎疫苗的研究进展
    2 体内诱导抗原技术(IVIAT)简介
        2.1 IVIAT的基本原理与实验流程
            2.1.1 血清的收集与处理
            2.1.2 构建基因组文库
            2.1.3 体内诱导表达基因的筛选
        2.2 IVIAT的应用
            2.2.1 IVIAT技术的优缺点
    3 研究的目的及意义
第二部分 研究部分
    第一章 胸膜肺炎放线杆菌的分离与鉴定
        1. 材料
            1.1 标准菌株和血清
            1.2 主要试剂和培养基
            1.3 分离病料
            1.4 主要仪器
        2 方法
            2.1 细菌的分离培养
            2.2 分离菌的病原特性观察
            2.3 分离菌的生化试验鉴定
            2.4 分离菌的PCR鉴定
            2.5 细菌血清型鉴定
            2.6 细菌的药敏试验
        3 结果
            3.1 细菌分离结果
            3.2 细菌培养特性
            3.3 细菌的生化特点
            3.4 细菌的PCR鉴定结果
            3.5 细菌的血清实验结果
            3.6 细菌的药敏试验结果
        4. 讨论
            4.1 胸膜肺炎放线杆菌的分离
            4.2 APP的鉴定
            4.3 血清分型与药敏试验
            4.4 APP分离鉴定的意义
    第二章 APP血清7型菌株基因表达文库的构建
        1. 材料
            1.1 菌株与质粒
            1.2 主要试剂
        2 方法
            2.1 APP血清7型菌株的活化
            2.2 APP7型菌株基因组提取
            2.3 APP7基因组酶切
                2.3.1 APP基因组酶切的酶量优化
                2.3.2 APP基因组DNA片段的回收
            2.4 构建文库使用载体的制备
                2.4.1 质粒pET28 a/b/c提取
                2.4.2 质粒pET28 a/b/c的BamHI的酶切及去磷酸化
            2.5 DH5a电转化感受态细胞的制备
            2.6 酶切片段与载体连接
                2.6.1 酶切片段与载体连接体系的优化
                2.6.2 连接
                2.6.3 连接产物的电转化
            2.7 再转化
            2.8 表达文库的PCR鉴定
                2.8.1 pET28系列通用引物设计
                2.8.2 重组质粒的PCR鉴定及插入率估算
            2.9 表达文库的酶切鉴定
        3 结果
            3.1 APP7基因组酶切优化结果
            3.2 APP7基因组酶大量酶切结果
            3.3 质粒pET28 a/b/c的提取与单酶切去磷酸化结果
            3.4 连接体系优化结果
            3.5 基因表达文库的PCR鉴定结果
            3.6 基因表达文库的双酶切鉴定结果
        4 讨论
            4.1 基因组的提取与部分酶切
            4.2 质粒pET28-a/b/c质粒的处理
            4.3 基因组与表达载体的连接
            4.4 文库的构建
    第三章 胸膜肺炎放线杆菌体内诱导抗原基因的筛选
        1 材料
            1.1 菌株、血清及实验动物
            1.2 主要试剂
            1.3 主要仪器设备
        2 方法
            2.1 康复血清的制备及效价测定
            2.2 血清吸附
                2.2.1 全细胞吸附
                2.2.2 细胞裂解物及热变性裂解物吸附
                2.2.3 血清的吸附效果检测
            2.3 基因组文库的筛选
        3 结果
            3.1 康复血清的制备结果
            3.2 康复血清的吸附效果
            3.3 APP血清7型体内诱导表达抗原的筛选
            3.4 阳性克隆测序结果
        4 讨论
            4.1 IVIAT在胸膜肺炎放线杆菌上的应用
            4.2 FTs A基因
            4.3 Fts K基因
结论
参考文献
致谢
附录


【参考文献】：
期刊论文
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博士论文
[1]猪传染性胃肠炎检测基因芯片与猪传染性胃肠炎病毒SC-H株N基因表达研究[D]. 黄小波.四川农业大学 2006

硕士论文
[1]中国猪链球菌2型强致病株体内诱导表达基因的筛选研究[D]. 宋洁.第三军医大学 2011
[2]胸膜肺炎放线杆菌体内诱导抗原的筛选与鉴定[D]. 师丽敏.华中农业大学 2010
[3]应用体内诱导抗原技术筛选仔猪大肠杆菌0139体内表达基因的初步研究[D]. 刘付敏.西南大学 2009
[4]淄博地区猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的分离鉴定及免疫预防研究[D]. 陈凯.山东农业大学 2007



本文编号：3331979