鸡λ干扰素在杆状病毒/昆虫细胞系统中表达及其抗病毒作用研究
发布时间：2021-08-15 01:35
干扰素（Interferon, IFN）是脊椎动物病毒防御系统的重要组成部分,主要分为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。其中Ⅲ型干扰素又称λ干扰素（IFN-λ）,是2003年发现的一种新型干扰素家族。Ⅲ型干扰素不仅具有与Ⅰ型干扰素相似的抗病毒活性,而且具有与Ⅱ型干扰素相似的免疫调节功能。IFN-λ受体分布的特异性,表明IFN-Xλ能够在一些上皮细胞及免疫细胞上发挥相对独立和特异的抗病毒作用。本研究以ChIFN-λ为研究对象,利用杆状病毒/昆虫细胞表达系统表达重组ChIFN-λ,初步开展了其抗病毒活性研究。本研究以鸡肾组织提取的总RNA为模板,利用RT-PCR方法扩增ChIFN-λ。序列分析表明ChIFN-λ全长561 bp,共编码186个氨基酸,其中前23个氨基酸构成ChIFN-λ,信号肽。亚克隆其成熟蛋白编码基因492 bp,将其克隆入pET-32a,构建原核表达载体pET-32a-ChIFN-λ,转化至大肠杆菌BL21（DE3）,利用IPTG诱导表达。SDS-PAGE分析证实表达产物为36 KD左右的融合蛋白,并且主要以不溶性包涵体存在。利用高亲和Ni-NTA层析树脂纯化表达产物,将其作为抗原免疫...
【文章来源】：扬州大学江苏省
【文章页数】：53 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
符号说明
第一章 综述Ⅲ型干扰素研究进展
1 Ⅲ型干扰素的基因结构及其编码蛋白
2 Ⅲ型干扰素的表达和调控
3 Ⅲ型干扰素的受体和信号通路
4 Ⅲ型干扰素的生物功能概述
4.1 抗病毒活性
4.2 抗肿瘤活性
4.3 免疫调节活性
第二章 鸡λ干扰素在杆状病毒/昆虫细胞系统中表达及其抗病毒作用研究
1 材料
1.1 实验动物
1.2 病毒及细胞
1.3 菌种及质粒
1.4 主要试剂
1.5 主要溶液配制
1.5.1 SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)主要试剂配制
1.5.2 Western blot主要试剂配制
1.5.3 ELISA主要试剂配制
1.5.4 蛋白纯化主要试剂配制
1.5.5 其他试剂配制
1.6 主要仪器
2 方法
2.1 ChIFN-λ基因的克隆与序列分析
2.1.1 鸡肾脏组织总RNA提取
2.1.2 引物设计与合成
2.1.3 RT-PCR
2.1.4 ChIFN-λ基因的克隆与序列分析
2.2 ChIFN-λ的原核表达
2.2.1 ChIFN-λ原核表达引物设计
2.2.2 ChIFN-λ成熟蛋白基因的克隆
2.2.3 重组质粒的构建
2.2.4 重组蛋白的诱导表达和条件优化
2.2.5 重组蛋白的大量诱导及纯化
2.3 ChIFN-λ多克隆抗体的制备
2.3.1 动物免疫
2.3.2 ELISA试验
2.4 表达ChIFN-λ重组杆状病毒的构建
2.4.1 gp67信号肽融合ChIFN-λ基因的扩增
2.4.2 转移载体pFastBac-gp67SP-ChIFN-λ的构建
2.4.3 转染昆虫细胞
2.5 重组蛋白的表达鉴定
2.5.1 间接免疫荧光实验
2.5.2 Western Blot实验
2.6 MTT方法检测重组ChIFN-λ的细胞毒性
2.7 CEK细胞的制备
2.8 半数组织细胞感染量测定
2.9 重组ChIFN-λ抗病毒活性测定
2.10 重组ChIFN-λ抗AIV、NDV效果研究
3 结果
3.1 ChIFN-λ的扩增及序列分析
3.1.1 ChIFN-λ全基因的RT-PCR扩增
3.1.2 测序结果及分析
3.2 ChIFN-λ原核表达
3.2.1 ChIFN-λ成熟蛋白基因的扩增
3.2.2 重组质粒pET-32a-ChIFN-λ的筛选和鉴定
3.2.3 重组蛋白表达和纯化鉴定
3.2.4 融合蛋白Western Blot检测
3.2.5 多克隆抗体的制备
3.3 表达ChIFN-λ重组杆状病毒的构建及鉴定
3.3.1 gp67信号肽序列扩增结果
3.3.2 ChIFN-λ去除信号肽片段的扩增
3.3.3 gp67信号肽融合ChIFN-λ基因的扩增
3.3.4 转移载体pFastBac-gp67SP-ChIFN-λ的酶切鉴定
3.3.5 穿梭质粒pFastBac-gp67SP-ChIFN-λ的PCR鉴定
3.3.6 转染Sf9细胞形态学变化
3.3.7 间接免疫荧光试验鉴定
3.3.8 重组杆状病毒Western Blot检测及抗病毒活性测定
3.3.9 MTT方法检测重组ChIFN-λ的细胞毒性
3.4 重组ChIFN-λ抗NDV和AIV的效果
3.4.1 ChIFN-λ抑制NDV F48E8株致细胞病变作用检测结果
3.4.2 ChIFN-λ抑制H9N2亚型AIV致细胞病变作用检测结果
4 讨论
全文结论
参考文献
致谢
攻读学位期间发表的学术论文目录
【参考文献】：
期刊论文
[1]禽类干扰素研究进展[J]. 冯书营,闫彬,曹颖. 中国家禽. 2013(12)
[2]Ⅲ型干扰素——新型抗病毒细胞因子[J]. 杨祎,侯炜. 生命科学. 2011(08)
本文编号：3343580
【文章来源】：扬州大学江苏省
【文章页数】：53 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
符号说明
第一章 综述Ⅲ型干扰素研究进展
1 Ⅲ型干扰素的基因结构及其编码蛋白
2 Ⅲ型干扰素的表达和调控
3 Ⅲ型干扰素的受体和信号通路
4 Ⅲ型干扰素的生物功能概述
4.1 抗病毒活性
4.2 抗肿瘤活性
4.3 免疫调节活性
第二章 鸡λ干扰素在杆状病毒/昆虫细胞系统中表达及其抗病毒作用研究
1 材料
1.1 实验动物
1.2 病毒及细胞
1.3 菌种及质粒
1.4 主要试剂
1.5 主要溶液配制
1.5.1 SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)主要试剂配制
1.5.2 Western blot主要试剂配制
1.5.3 ELISA主要试剂配制
1.5.4 蛋白纯化主要试剂配制
1.5.5 其他试剂配制
1.6 主要仪器
2 方法
2.1 ChIFN-λ基因的克隆与序列分析
2.1.1 鸡肾脏组织总RNA提取
2.1.2 引物设计与合成
2.1.3 RT-PCR
2.1.4 ChIFN-λ基因的克隆与序列分析
2.2 ChIFN-λ的原核表达
2.2.1 ChIFN-λ原核表达引物设计
2.2.2 ChIFN-λ成熟蛋白基因的克隆
2.2.3 重组质粒的构建
2.2.4 重组蛋白的诱导表达和条件优化
2.2.5 重组蛋白的大量诱导及纯化
2.3 ChIFN-λ多克隆抗体的制备
2.3.1 动物免疫
2.3.2 ELISA试验
2.4 表达ChIFN-λ重组杆状病毒的构建
2.4.1 gp67信号肽融合ChIFN-λ基因的扩增
2.4.2 转移载体pFastBac-gp67SP-ChIFN-λ的构建
2.4.3 转染昆虫细胞
2.5 重组蛋白的表达鉴定
2.5.1 间接免疫荧光实验
2.5.2 Western Blot实验
2.6 MTT方法检测重组ChIFN-λ的细胞毒性
2.7 CEK细胞的制备
2.8 半数组织细胞感染量测定
2.9 重组ChIFN-λ抗病毒活性测定
2.10 重组ChIFN-λ抗AIV、NDV效果研究
3 结果
3.1 ChIFN-λ的扩增及序列分析
3.1.1 ChIFN-λ全基因的RT-PCR扩增
3.1.2 测序结果及分析
3.2 ChIFN-λ原核表达
3.2.1 ChIFN-λ成熟蛋白基因的扩增
3.2.2 重组质粒pET-32a-ChIFN-λ的筛选和鉴定
3.2.3 重组蛋白表达和纯化鉴定
3.2.4 融合蛋白Western Blot检测
3.2.5 多克隆抗体的制备
3.3 表达ChIFN-λ重组杆状病毒的构建及鉴定
3.3.1 gp67信号肽序列扩增结果
3.3.2 ChIFN-λ去除信号肽片段的扩增
3.3.3 gp67信号肽融合ChIFN-λ基因的扩增
3.3.4 转移载体pFastBac-gp67SP-ChIFN-λ的酶切鉴定
3.3.5 穿梭质粒pFastBac-gp67SP-ChIFN-λ的PCR鉴定
3.3.6 转染Sf9细胞形态学变化
3.3.7 间接免疫荧光试验鉴定
3.3.8 重组杆状病毒Western Blot检测及抗病毒活性测定
3.3.9 MTT方法检测重组ChIFN-λ的细胞毒性
3.4 重组ChIFN-λ抗NDV和AIV的效果
3.4.1 ChIFN-λ抑制NDV F48E8株致细胞病变作用检测结果
3.4.2 ChIFN-λ抑制H9N2亚型AIV致细胞病变作用检测结果
4 讨论
全文结论
参考文献
致谢
攻读学位期间发表的学术论文目录
【参考文献】：
期刊论文
[1]禽类干扰素研究进展[J]. 冯书营,闫彬,曹颖. 中国家禽. 2013(12)
[2]Ⅲ型干扰素——新型抗病毒细胞因子[J]. 杨祎,侯炜. 生命科学. 2011(08)
本文编号：3343580
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