小反刍兽疫病毒Nigeria 75/1株病毒样颗粒的构建及其免疫原性
发布时间：2021-08-16 10:17
为了构建具有天然构象的小反刍兽疫病毒Nigeria 75/1株病毒样颗粒,本试验扩增了Nigeria 75/1株M、F和H基因,并分别克隆至双启动子载体pFastBacTM Dual中,构建含有双目的基因的重组供体质粒pFastBacTM Dual-2M、pFastBacTM Dual-2F和pFastBacTM Dual-2H;测序正确后转化至DH10BacTM 感受态细胞,同源重组获得穿梭质粒rBacmid-2M、rBacmid-2F和rBacmid-2H;将其分别转染昆虫细胞Sf9获得重组杆状病毒rpFB-2M、rpFB-2F和rpFB-2H。以鼠抗M、H蛋白的主要抗原表位区多克隆抗体与绵羊抗PPRV阳性血清对重组杆状病毒感染细胞进行间接免疫荧光（IFA）鉴定,可见特异性荧光;以3种重组杆状病毒共感染昆虫细胞Sf9的方式组装病毒样颗粒,放大培养后进行病毒样颗粒纯化。Western blot检测纯化后样品可见相对分子质量为38 000,59 000,68 000左右的条带,...
【文章来源】：中国兽医学报. 2017,37(07)北大核心CSCD
【文章页数】：9 页
【部分图文】：
图２重组杆状病毒的拯救结果Ａ．发生病变的Ｓｆ９细胞；Ｂ．正常的Ｓｆ９细胞
显，表现为细胞出现膨大、脱壁悬涪聚集现象（图２Ａ），病变细胞形态明显区别于正常细胞（图２Ｂ）。图２重组杆状病毒的拯救结果Ａ．发生病变的Ｓｆ９细胞；Ｂ．正常的Ｓｆ９细胞２．３重组杆状病毒滴度测定将第３代病毒种ｒｐＦＢ－２Ｍ、ｒｐＦＢ－２Ｆ、ｒｐＦＢ－２Ｈ用ＢａｃＰＡＫＴＭＢａｃｕ－ｌｏｖｉｒｕｓＲａｐｉｄＴｉｔｅｒＫｉｔ试剂盒进行滴定，镜下可见散在的染色斑点，结果显示ｒｐＦＢ－２Ｍ滴度为４．０×１０７ＰＦＵ／ｍＬ（图３）。应用同样的方法测得ｒｐＦＢ－２Ｆ、ｒｐＦＢ－２Ｈ滴度为３．７×１０７ＰＦＵ／ｍＬ和５．４×１０７ＰＦＵ／ｍＬ。图３重组杆状病毒滴定结果Ａ．１０４稀释度重组杆状病毒ｒｐＦＢ－２Ｍ滴定结果；Ｂ．１０４稀释度重组杆状病毒ｒｐＦＢ－２Ｆ滴定结果；Ｃ．１０４稀释度重组杆状病毒ｒｐＦＢ－２Ｈ滴定结果；Ｄ．正常的Ｓｆ９细胞２．４重组杆状病毒的间接免疫荧光检测（ＩＦＡ）将重组杆状病毒ｒｐＦＢ－２Ｍ、ｒｐＦＢ－２Ｆ、ｒｐＦＢ－２Ｈ及野生型杆状病毒分别接种昆虫Ｓｆ９细胞４８ｈ后，进行间接免疫荧光染色，结果显示重组杆状病毒表达的ＰＰＲＶＭ、Ｆ、Ｈ蛋白均可被相应的鼠抗Ｍ、Ｆ和Ｈ多克隆抗体特异性识别。荧光显微镜下可见绿色荧光，而感染野生杆状病毒的昆虫细胞与未感染杆状病毒的正常昆虫细胞则无特异性荧光反应，仅呈现红色细胞背景（图４），表明重组杆状病毒构建成功。图４间接免疫荧光检测重组蛋白表达结果Ａ．重组杆状病毒ｒｐＦＢ－２Ｍ感染的
图５病毒样颗粒的构建与纯化Ａ．蔗糖密度梯度；Ｂ．ＰＰＲＶ病毒样颗粒；Ｃ．ＰＰＲＶ图６ＳＤＳ－ＰＡＧＥ与Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测重组蛋白表达结果Ｍ．蛋白分子相对分子质量标准；Ａ１、Ｂ１、Ｃ１．野生杆状病毒感染的Ｓｆ９细胞；Ａ２、Ｂ２、Ｃ２．重组杆状毒ｒｐＦＢ－２Ｍ／ｒｐＦＢ－２Ｆ／ｒｐＦＢ－２Ｈ感染的Ｓｆ９细胞２．７小鼠免疫以纯化的ＰＰＲＶ病毒样颗粒（ＶＬＰｓ）免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，小鼠血清ＰＰＲＶ中和抗体检测结果表明，ＰＢＳ对照组在整个试验过程中没有检测到中和抗体，病毒样颗粒免疫组首次免疫２周后，可以在部分小鼠体内检测到抗ＰＰＲＶ中和抗体，抗体阳性率为５０％；在第２周加强免疫后，中和抗体开始上升，小鼠血清阳性率提高到８０％；在第２次免疫２周后继续加强免疫，血清阳性率上升至９０％（表１）。表１血清中和抗体效价检测组别免疫前首免后２周二免疫后２周三免疫后２周ＰＰＲＶ－ＶＬＰｓ＜１∶４（０／１０）１∶４～１∶１６（５／１０）１∶４～１∶３２（８／１０）１∶１６～１∶６４（９／１０）ＰＢＳ＜１∶４（０／１０）＜１∶４～１∶８（０／１０）＜１∶４～１∶８（０／１０）＜１∶４～１∶８（０／１０）注：“（）”内数字的含义：前边数字代表ＰＰＲＶ中和抗体阳性的小鼠数目，后面数字代表各组小鼠数量３讨论目前，小反刍兽疫主要依赖疫苗免疫预防，采用感染山羊的病理组织制备的小反刍兽疫灭活疫苗，一般采用甲醛或氯仿灭活，用甲醛灭活的疫苗免疫
【参考文献】：
期刊论文
[1]小反刍兽疫病原及疫苗的研究进展[J]. 吴炳秀,和丽英. 当代畜禽养殖业. 2015(04)
[2]小反刍兽疫07株H蛋白在昆虫细胞中的表达及其抗原性鉴定[J]. 赵文年,包静月,王清华,刘春菊,王淑娟,雷程红,王志亮. 中国兽医杂志. 2014(10)
[3]小反刍兽疫病毒H基因在杆状病毒中的表达及其免疫原性研究[J]. 隋修锟,金红岩,李文超,史利军,赵占中,梁琳,李刚. 畜牧兽医学报. 2014(06)
[4]从消灭牛瘟分析全球根除小反刍兽疫的可行性[J]. 刘拂晓,柳增善,王志亮. 病毒学报. 2012(01)
[5]小反刍兽疫病毒致病性的研究进展[J]. 蒙学莲,才学鹏. 中国兽医科学. 2010(07)
[6]用于药用蛋白生产的外源表达系统[J]. 董文博,陈洪栋,郝建国,李红民. 基因组学与应用生物学. 2009(04)
[7]病毒样颗粒疫苗及载体的研究进展[J]. 赵朴,郑玉姝,刘兴友. 中国生物制品学杂志. 2009(05)
博士论文
[1]小反刍兽疫病毒样颗粒的构建及对小鼠免疫效力的评价[D]. 刘拂晓.吉林大学 2013
硕士论文
[1]杆状病毒携带的基因拷贝数与重组蛋白表达效率关系研究[D]. 楚素霞.河南师范大学 2011
本文编号：3345486
【文章来源】：中国兽医学报. 2017,37(07)北大核心CSCD
【文章页数】：9 页
【部分图文】：
图２重组杆状病毒的拯救结果Ａ．发生病变的Ｓｆ９细胞；Ｂ．正常的Ｓｆ９细胞
显，表现为细胞出现膨大、脱壁悬涪聚集现象（图２Ａ），病变细胞形态明显区别于正常细胞（图２Ｂ）。图２重组杆状病毒的拯救结果Ａ．发生病变的Ｓｆ９细胞；Ｂ．正常的Ｓｆ９细胞２．３重组杆状病毒滴度测定将第３代病毒种ｒｐＦＢ－２Ｍ、ｒｐＦＢ－２Ｆ、ｒｐＦＢ－２Ｈ用ＢａｃＰＡＫＴＭＢａｃｕ－ｌｏｖｉｒｕｓＲａｐｉｄＴｉｔｅｒＫｉｔ试剂盒进行滴定，镜下可见散在的染色斑点，结果显示ｒｐＦＢ－２Ｍ滴度为４．０×１０７ＰＦＵ／ｍＬ（图３）。应用同样的方法测得ｒｐＦＢ－２Ｆ、ｒｐＦＢ－２Ｈ滴度为３．７×１０７ＰＦＵ／ｍＬ和５．４×１０７ＰＦＵ／ｍＬ。图３重组杆状病毒滴定结果Ａ．１０４稀释度重组杆状病毒ｒｐＦＢ－２Ｍ滴定结果；Ｂ．１０４稀释度重组杆状病毒ｒｐＦＢ－２Ｆ滴定结果；Ｃ．１０４稀释度重组杆状病毒ｒｐＦＢ－２Ｈ滴定结果；Ｄ．正常的Ｓｆ９细胞２．４重组杆状病毒的间接免疫荧光检测（ＩＦＡ）将重组杆状病毒ｒｐＦＢ－２Ｍ、ｒｐＦＢ－２Ｆ、ｒｐＦＢ－２Ｈ及野生型杆状病毒分别接种昆虫Ｓｆ９细胞４８ｈ后，进行间接免疫荧光染色，结果显示重组杆状病毒表达的ＰＰＲＶＭ、Ｆ、Ｈ蛋白均可被相应的鼠抗Ｍ、Ｆ和Ｈ多克隆抗体特异性识别。荧光显微镜下可见绿色荧光，而感染野生杆状病毒的昆虫细胞与未感染杆状病毒的正常昆虫细胞则无特异性荧光反应，仅呈现红色细胞背景（图４），表明重组杆状病毒构建成功。图４间接免疫荧光检测重组蛋白表达结果Ａ．重组杆状病毒ｒｐＦＢ－２Ｍ感染的
图５病毒样颗粒的构建与纯化Ａ．蔗糖密度梯度；Ｂ．ＰＰＲＶ病毒样颗粒；Ｃ．ＰＰＲＶ图６ＳＤＳ－ＰＡＧＥ与Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测重组蛋白表达结果Ｍ．蛋白分子相对分子质量标准；Ａ１、Ｂ１、Ｃ１．野生杆状病毒感染的Ｓｆ９细胞；Ａ２、Ｂ２、Ｃ２．重组杆状毒ｒｐＦＢ－２Ｍ／ｒｐＦＢ－２Ｆ／ｒｐＦＢ－２Ｈ感染的Ｓｆ９细胞２．７小鼠免疫以纯化的ＰＰＲＶ病毒样颗粒（ＶＬＰｓ）免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，小鼠血清ＰＰＲＶ中和抗体检测结果表明，ＰＢＳ对照组在整个试验过程中没有检测到中和抗体，病毒样颗粒免疫组首次免疫２周后，可以在部分小鼠体内检测到抗ＰＰＲＶ中和抗体，抗体阳性率为５０％；在第２周加强免疫后，中和抗体开始上升，小鼠血清阳性率提高到８０％；在第２次免疫２周后继续加强免疫，血清阳性率上升至９０％（表１）。表１血清中和抗体效价检测组别免疫前首免后２周二免疫后２周三免疫后２周ＰＰＲＶ－ＶＬＰｓ＜１∶４（０／１０）１∶４～１∶１６（５／１０）１∶４～１∶３２（８／１０）１∶１６～１∶６４（９／１０）ＰＢＳ＜１∶４（０／１０）＜１∶４～１∶８（０／１０）＜１∶４～１∶８（０／１０）＜１∶４～１∶８（０／１０）注：“（）”内数字的含义：前边数字代表ＰＰＲＶ中和抗体阳性的小鼠数目，后面数字代表各组小鼠数量３讨论目前，小反刍兽疫主要依赖疫苗免疫预防，采用感染山羊的病理组织制备的小反刍兽疫灭活疫苗，一般采用甲醛或氯仿灭活，用甲醛灭活的疫苗免疫
【参考文献】：
期刊论文
[1]小反刍兽疫病原及疫苗的研究进展[J]. 吴炳秀,和丽英. 当代畜禽养殖业. 2015(04)
[2]小反刍兽疫07株H蛋白在昆虫细胞中的表达及其抗原性鉴定[J]. 赵文年,包静月,王清华,刘春菊,王淑娟,雷程红,王志亮. 中国兽医杂志. 2014(10)
[3]小反刍兽疫病毒H基因在杆状病毒中的表达及其免疫原性研究[J]. 隋修锟,金红岩,李文超,史利军,赵占中,梁琳,李刚. 畜牧兽医学报. 2014(06)
[4]从消灭牛瘟分析全球根除小反刍兽疫的可行性[J]. 刘拂晓,柳增善,王志亮. 病毒学报. 2012(01)
[5]小反刍兽疫病毒致病性的研究进展[J]. 蒙学莲,才学鹏. 中国兽医科学. 2010(07)
[6]用于药用蛋白生产的外源表达系统[J]. 董文博,陈洪栋,郝建国,李红民. 基因组学与应用生物学. 2009(04)
[7]病毒样颗粒疫苗及载体的研究进展[J]. 赵朴,郑玉姝,刘兴友. 中国生物制品学杂志. 2009(05)
博士论文
[1]小反刍兽疫病毒样颗粒的构建及对小鼠免疫效力的评价[D]. 刘拂晓.吉林大学 2013
硕士论文
[1]杆状病毒携带的基因拷贝数与重组蛋白表达效率关系研究[D]. 楚素霞.河南师范大学 2011
本文编号：3345486
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/dongwuyixue/3345486.html
