电转染制作广西巴马小型猪转基因克隆胚胎
发布时间：2021-08-20 19:37
我国是一个养猪大国,同时也具有丰富的地方特色猪品种。但是许多优秀地方特色猪种并没有充分得到利用,其开发利用和发掘的潜力是非常巨大的,广西巴马小型猪作为我国特有的一种小型猪品系,其遗传及表型特征稳定,同时在生理和解剖学等方面与人类相似,已被用于外科训练、药物评价及人类异种皮肤移植试验。开展广西巴马小型猪转基因克隆研究仅有效保存地方猪的优秀遗传特性,而且还为人类生物和医学领域提供理想的动物模型,有助于提升地方猪的应用范围和价值。因此以广西巴马小型猪为研究对象是一种理想生物和医学模型。本研究采用胰蛋白酶法制备新生广西巴马小型猪肾脏成纤维细胞,建立巴马小型猪肾脏成纤维细胞体系。以PEGFP-N1质粒用于电转染成纤维细胞并优化电转染参数,在优化的电转染参数下转染成纤维细胞并成功筛选出阳性成纤维细胞。以筛选出的转基因成纤维细胞为供体细胞,成功构建了转基因克隆胚胎。通过胚胎移植来进一步在体内验证转基因克隆胚胎的生育能力,并尝试为构建存活的转基因克隆猪提供了支持。为构建转基因克隆胚胎,我们开展了如下试验：实验一、以巴马小型猪新生猪仔为材料,采用胰蛋白酶消化法来建立巴巴小型猪肾脏成纤维细胞体系。并成功获...
【文章来源】：广西大学广西壮族自治区 211工程院校
【文章页数】：64 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
新生广西巴马小型猪肾脏成纤维细胞系的建立A、消化后的细胞；B、培养2h后贴壁细胞；C、原代细胞长至汇合；D、传代一次的成纤维细胞；E、解冻2h的成纤维细胞；F、解冻细胞培养2d
本试验对电压造成细胞电转染效率影响进行了研究。研究发现不同电压对细胞的转染效率是不同的，转染后的细胞在培养24小时后进行转染率检测，如图2-2B所示：随着电压增大，表达绿色突光的细胞比例逐渐升高，当电压为140V时转染率最高达到16.5±2.2%,虽然其在数值上高于]20v( 15.0±2.1 %)和160v( 16.3±2.1 %)组，但差异不显著（p>0.05)。80v(9.7±2.3%)和100v(12.2±2.6%)组之间差异不显著(p>0.05),两组均显著低于120v、140v和160v组(p<0.05)。表明在一定程度上加大电压量可以提高细胞转率效率，但过高也对转染不利。通过对细胞存活率和细胞电转染效率进行综合考虑比较发现：120V组在保存50%左右细胞存活的同时可以获得相对较高的转染率，因此是本实验室条件下的最佳电压，随后采用该电压用于构建转基因体细胞。33
但均无显著差异（p>0.05)。GFP-NT克隆胚胎在各个体外发育时期均高效表达GFP(图2-5C，D)，表明转基因己稳定整合到体细胞基因组并能高效表达。转基因供体细胞具有完全重编程发育能力，因此，本实验室构建的新生广西巴马小型猪肾脏成纤维细胞经优化的电转染体系进行转基因操作后，具有完全的核重编程能力，从而为进一步构建转基因克隆猪奠定了基础。BH图2-5各个发育时期的转GFP克隆胚胎A、_SCNT操作；B、核移植重构胚C、2-4-细胞期克隆胚胎；D、囊胚期克隆胚胎。(标尺=100|im)Fig.2-6 GFP transgenic cloned embryos at each development periods in vitro.A. Operation of SCNT; B. Reconstructed embryos after SCNT; C. Cloned 2-4-cell embryos; D.Cloned blastocysts. (Scale bar=100|im)表2 C-NT和GFP-NT克隆胚胎的体外发育Table2 The development of C-NT and GFP-NT cloned embryos in vitro胚胎类型 培养数 分裂数（率?
【参考文献】：
期刊论文
[1]电转染法制备奶牛转溶葡球菌酶（Lysostaphin）和内溶素（Endolysin）基因胚胎[J]. 杨林,杜卫华,郝海生,刘岩,秦彤,赵学明,王栋,朱化彬,王宗礼. 农业生物技术学报. 2013(02)
[2]猪克隆胚胎激活方法优化与转人溶菌酶基因克隆猪的生产[J]. 卫恒习,李俊,童佳,马育芳,高凤磊,李秋艳,张守全,李宁. 生物化学与生物物理进展. 2013(01)
[3]脂质体介导质粒DNA细胞转染的优化研究（英文）[J]. Mingang Ying,Changhua Zhuo,Weidong Zang Department of Abdominal Surgery,Fujian Provincial Cancer Hospital,Teaching Hospital of Fujian Medical University,Fuzhou 350014,China. Chinese-German Journal of Clinical Oncology. 2011(05)
[4]悬浮细胞电穿孔转染参数的选择研究[J]. 樊占威,王晗,王柏春,刘宏宇. 黑龙江医学. 2010(12)
[5]巨噬细胞RAW264.7的培养及电转染条件的优化[J]. 宋永利,陆昕,邱爽,祁英培,华松,兰杰,何小宁,贺小英,张涌,郑月茂. 西北农业学报. 2010(09)
[6]原代大鼠肾小球系膜细胞最佳电转染条件的探索和验证[J]. 徐锋,吕杨,谢院生,李晓帆,崔文鹏,苗里宁,陈香美. 军医进修学院学报. 2010(05)
[7]质粒电穿孔转染条件的选择[J]. 杨薇,王迪,陈克清,于敏,王桂华,胡俊波,王晶. 华中科技大学学报(医学版). 2009(06)
[8]体细胞核移植生产转ω-3脂肪酸去饱和酶基因（sFat-1）的猪胚胎[J]. 冯冲,周艳荣,龙川,刘晓,陈红星,潘登科,杨博辉. 畜牧兽医学报. 2009(05)
[9]体细胞核移植生产转ω-3脂肪酸去饱和酶基因sFat-1克隆猪[J]. 潘登科,张莉,周艳荣,冯冲,龙川,刘晓,董恩球,王树臣,万荣,张健,陈红星. 中国科学（C辑:生命科学）. 2009(03)
[10]利用体细胞核移植技术生产表达增强绿色荧光蛋白（EGFP）的转人溶菌酶基因（HLY）的猪克隆胚胎[J]. 李秋艳,卫恒习,郭英,李燕,赵蕊,于政权,汤波,张磊,戴蕴平,李宁. 自然科学进展. 2008(10)
博士论文
[1]利用体细胞核移植技术生产猪克隆胚胎的研究[D]. 张运海.中国农业大学 2005
本文编号：3354106
【文章来源】：广西大学广西壮族自治区 211工程院校
【文章页数】：64 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
新生广西巴马小型猪肾脏成纤维细胞系的建立A、消化后的细胞；B、培养2h后贴壁细胞；C、原代细胞长至汇合；D、传代一次的成纤维细胞；E、解冻2h的成纤维细胞；F、解冻细胞培养2d
本试验对电压造成细胞电转染效率影响进行了研究。研究发现不同电压对细胞的转染效率是不同的，转染后的细胞在培养24小时后进行转染率检测，如图2-2B所示：随着电压增大，表达绿色突光的细胞比例逐渐升高，当电压为140V时转染率最高达到16.5±2.2%,虽然其在数值上高于]20v( 15.0±2.1 %)和160v( 16.3±2.1 %)组，但差异不显著（p>0.05)。80v(9.7±2.3%)和100v(12.2±2.6%)组之间差异不显著(p>0.05),两组均显著低于120v、140v和160v组(p<0.05)。表明在一定程度上加大电压量可以提高细胞转率效率，但过高也对转染不利。通过对细胞存活率和细胞电转染效率进行综合考虑比较发现：120V组在保存50%左右细胞存活的同时可以获得相对较高的转染率，因此是本实验室条件下的最佳电压，随后采用该电压用于构建转基因体细胞。33
但均无显著差异（p>0.05)。GFP-NT克隆胚胎在各个体外发育时期均高效表达GFP(图2-5C，D)，表明转基因己稳定整合到体细胞基因组并能高效表达。转基因供体细胞具有完全重编程发育能力，因此，本实验室构建的新生广西巴马小型猪肾脏成纤维细胞经优化的电转染体系进行转基因操作后，具有完全的核重编程能力，从而为进一步构建转基因克隆猪奠定了基础。BH图2-5各个发育时期的转GFP克隆胚胎A、_SCNT操作；B、核移植重构胚C、2-4-细胞期克隆胚胎；D、囊胚期克隆胚胎。(标尺=100|im)Fig.2-6 GFP transgenic cloned embryos at each development periods in vitro.A. Operation of SCNT; B. Reconstructed embryos after SCNT; C. Cloned 2-4-cell embryos; D.Cloned blastocysts. (Scale bar=100|im)表2 C-NT和GFP-NT克隆胚胎的体外发育Table2 The development of C-NT and GFP-NT cloned embryos in vitro胚胎类型 培养数 分裂数（率?
【参考文献】：
期刊论文
[1]电转染法制备奶牛转溶葡球菌酶（Lysostaphin）和内溶素（Endolysin）基因胚胎[J]. 杨林,杜卫华,郝海生,刘岩,秦彤,赵学明,王栋,朱化彬,王宗礼. 农业生物技术学报. 2013(02)
[2]猪克隆胚胎激活方法优化与转人溶菌酶基因克隆猪的生产[J]. 卫恒习,李俊,童佳,马育芳,高凤磊,李秋艳,张守全,李宁. 生物化学与生物物理进展. 2013(01)
[3]脂质体介导质粒DNA细胞转染的优化研究（英文）[J]. Mingang Ying,Changhua Zhuo,Weidong Zang Department of Abdominal Surgery,Fujian Provincial Cancer Hospital,Teaching Hospital of Fujian Medical University,Fuzhou 350014,China. Chinese-German Journal of Clinical Oncology. 2011(05)
[4]悬浮细胞电穿孔转染参数的选择研究[J]. 樊占威,王晗,王柏春,刘宏宇. 黑龙江医学. 2010(12)
[5]巨噬细胞RAW264.7的培养及电转染条件的优化[J]. 宋永利,陆昕,邱爽,祁英培,华松,兰杰,何小宁,贺小英,张涌,郑月茂. 西北农业学报. 2010(09)
[6]原代大鼠肾小球系膜细胞最佳电转染条件的探索和验证[J]. 徐锋,吕杨,谢院生,李晓帆,崔文鹏,苗里宁,陈香美. 军医进修学院学报. 2010(05)
[7]质粒电穿孔转染条件的选择[J]. 杨薇,王迪,陈克清,于敏,王桂华,胡俊波,王晶. 华中科技大学学报(医学版). 2009(06)
[8]体细胞核移植生产转ω-3脂肪酸去饱和酶基因（sFat-1）的猪胚胎[J]. 冯冲,周艳荣,龙川,刘晓,陈红星,潘登科,杨博辉. 畜牧兽医学报. 2009(05)
[9]体细胞核移植生产转ω-3脂肪酸去饱和酶基因sFat-1克隆猪[J]. 潘登科,张莉,周艳荣,冯冲,龙川,刘晓,董恩球,王树臣,万荣,张健,陈红星. 中国科学（C辑:生命科学）. 2009(03)
[10]利用体细胞核移植技术生产表达增强绿色荧光蛋白（EGFP）的转人溶菌酶基因（HLY）的猪克隆胚胎[J]. 李秋艳,卫恒习,郭英,李燕,赵蕊,于政权,汤波,张磊,戴蕴平,李宁. 自然科学进展. 2008(10)
博士论文
[1]利用体细胞核移植技术生产猪克隆胚胎的研究[D]. 张运海.中国农业大学 2005
本文编号：3354106
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