非洲猪瘟病毒p54重组蛋白的原核表达及其单克隆抗体制备

发布时间：2021-09-04 23:41

　　非洲猪瘟（African swine fever, ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus, ASFV）感染引起的猪的高度接触传染性疾病,死亡率高达100%。ASF长期在非洲流行,近年来流行范围有逐渐扩大的趋势,目前已经蔓延至俄罗斯等邻国,使我国养猪业面临巨大威胁。ASF无任何疫苗用于防疫,因此建立快速、准确的诊断方法对于防止该病传入和扩散具有重要意义。p54是ASFV的重要结构蛋白,具有较强的免疫原性,因此常被用来检测抗原,同时用重组蛋白代替活病毒抗原增加了检测的安全性。本研究通过聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）扩增ASFV p54基因,插入原核表达载体pET-30a,将重组质粒pET30a-P54转化BLR（DE3）大肠杆菌,用IPTG诱导重组蛋白表达。SDS-PAGE分析结果显示,表达的His-p54融合蛋白为预期的21kD,且为可溶性表达。用镍亲和层析柱纯化表达产物,得到了纯度较高的His-p54融合蛋白。用纯化的His-p54蛋白免疫BALB/c小鼠,采集脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合... 

【文章来源】：扬州大学江苏省

【文章页数】：48 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
中文摘要
Abstract
目录
符号说明
文献综述
    1. 非洲猪瘟病毒
        1.1 病毒分类
        1.2 病毒粒子的形态和结构
        1.3 病毒基因组
        1.4 基因组编码的蛋白
        1.5 非洲猪瘟病毒的感染机制
    2. 非洲猪瘟的流行病学特点
    3. 非洲猪瘟病的临床症状与病理变化
        3.1 非洲猪瘟病的临床症状
        3.2 非洲猪瘟病的剖检变化
    4. 非洲猪瘟病毒的诊断
        4.1 血细胞吸附试验(HAD)
        4.2 ASFV抗原检测
        4.3 病毒抗体试验
    5. 非洲猪瘟病的防治措施
    参考文献
研究内容一：非洲猪癌病毒p54重组蛋白的原核表达及纯化
    摘要
    1. 材料
        1.1 菌株和质粒
        1.2 工具酶和试剂
        1.3 培养基
        1.4 引物
        1.5 常用溶液
        1.6 主要仪器
    2. 方法
        2.1 非洲猪瘟病毒p54基因的扩增
        2.2 PCR产物的回收
        2.3 验证载体pMD18T-p54的构建
        2.4 表达载体pET-P54的构建
        2.5 重组蛋白诱导表达及分析
        2.6 重组蛋白的纯化
        2.7 重组蛋白免疫原性检测
    3. 结果
        3.1 p54基因的扩增
        3.2 重组载体的鉴定
        3.3 表达载体鉴定
        3.4 重组蛋白诱导表达及分析
        3.5 重组蛋白纯化结果
        3.6 重组蛋白免疫原性检测结果
    4. 讨论
    参考文献
研究内容二 非洲猪瘟病毒p54蛋白单克隆抗体的制备
    摘要
    1. 材料
        1.1 细胞和实验动物
        1.2 主要试剂
        1.3 培养基
        1.4 主要仪器
    2. 方法
        2.1 小鼠的免疫
        2.2 饲养细胞的采集
        2.3 骨髓瘤细胞S/P20的准备
        2.4 脾细胞的采集
        2.5 细胞融合
        2.6 阳性克隆的筛选
        2.7 阳性杂交瘤细胞的亚克隆
        2.8 腹水的制备
        2.9 单克隆抗体的亚类鉴定
        2.10 单克隆抗体的特异性检测
        2.11 单克隆抗体效价的检测
    3. 结果
        3.1 抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释倍数的确定
        3.2 杂交瘤细胞筛选及亚克隆
        3.3 单克隆抗体亚类的鉴定
        3.4 单克隆抗体特异性检测
        3.5 腹水单克隆抗体的效价测定
    4. 讨论
    参考文献
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]非洲猪瘟病毒p54蛋白的高效表达及在ELISA中的应用[J]. 龚振华,王丽萍,臧京帅,张康,刘春菊,吴晓东,张启迪,秦晓冰,陈琳琳,单虎,王树双,王志亮.  畜牧兽医学报. 2013(11)
[2]非洲猪瘟病毒实时荧光定量PCR检测技术的研究与评价[J]. 郭少平,刘建,吴绍强.  中国畜牧兽医. 2010(04)
[3]非洲猪瘟病毒P54基因原核表达载体的构建与表达[J]. 侯艳梅,董志珍,赵祥平,李琳,肖妍,陈本龙,蔡国瑞,栾慎顺,王建华.  中国兽医科学. 2009(04)
[4]非洲猪瘟流行病学和诊断方法的研究进展[J]. 王华,王君玮,徐天刚,王志亮.  中国兽医科学. 2008(06)
[5]融合标签技术及其应用[J]. 李永进,陈媛媛,毕利军.  生物工程学报. 2006(04)
[6]非洲猪瘟间接ELISA诊断试剂盒的研究[J]. 蒋正军,马世东,蔡丽娟,单文鲁,王树双,尹燕博,龚振华,李葳,宣华.  中国预防兽医学报. 2000(S1)
[7]不同非洲猪瘟病毒株j5R基因及其编码蛋白的比较[J]. 孙怀昌,Ｌｉｎｄａ ＫＤｉｘｏｎ,Ｒ Ｍ Ｅ Ｐａｒｋｈｏｕｓｅ.  中国预防兽医学报. 1999(02)



本文编号：3384229