用于间接免疫荧光检测的羊口疮病毒单抗杂交瘤细胞的筛选与鉴定

发布时间：2021-09-11 21:57

　　羊口疮（Orf）是一种急性、高度接触性传染病,对绵羊和山羊等小反刍经济动物健康养殖影响较大,引发该病的病原是羊口疮病毒（Orf virus,ORFV）。常规ORFV检测方法,如间接ELISA、PCR、细胞培养技术等,在Orf的流行病学调研、病原特性和病毒鉴定等方面的研究中发挥了极其重要的作用,但难以满足对感染组织器官和细胞中的ORFV抗原进行定位和直观判断的试验目的。间接免疫荧光（IFA）可特异、直观地检出组织细胞上的病毒抗原,在细胞水平对抗原进行定位,因此获得理化性状均一,结合抗原特异性强的ORFV的单抗,对于病毒的实验室研究和诊断等深入探究具有重要的价值。本研究以羊口疮疑似组织病料为材料,采用PCR、细胞培养技术等,对临床样品进行了检测和ORFV分离鉴定;以接种了ORFV的牛睾丸上皮细胞为检测标本,未经亚克隆化的ORFV杂交瘤细胞为材料,采用有限稀释法、间接免疫荧光试验（IFA）,筛选分泌抗ORFV单抗的杂交瘤细胞,并对其进行鉴定。ORFV阳性山羊口唇部组织,制备冰冻组织切片,用经过鉴定的ORFV单抗进行IFA试验检测。本研究获得如下结果:1.从临床羊口疮疑似病料中分离出了一株羊口... 

【文章来源】：西北农林科技大学陕西省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：57 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
文献综述
    第一章 羊口疮研究进展
        1.1 病原学及基因组
        1.2 流行病学特征
        1.3 病毒毒力因子与宿主免疫逃避
        1.4 ORFV感染宿主的免疫应答
        1.5 实验室诊断
            1.5.1 显微镜检查
            1.5.2 血清学检测
            1.5.3 分子实验
        1.6 羊口疮病毒单抗研究进展
        1.7 本研究的目的及意义
试验研究
    第二章 羊口疮病毒凤翔株的分离和鉴定
        2.1 材料
            2.1.1 病料来源
            2.1.2 细胞与菌株
            2.1.3 主要试剂和材料
            2.1.4 主要仪器
            2.1.5 主要试剂的配置
        2.2 方法
            2.2.1 病料的处理
            2.2.2 引物设计
            2.2.3 DNA的提取
            2.2.4 PCR检测
            2.2.5 牛睾丸上皮细胞的培养
            2.2.6 羊口疮病毒的接种
            2.2.7 ORFV的鉴定
            2.2.8 B2L基因序列分析与进化树的绘制
            2.2.9 TCID50 的测定
        2.3 结果
            2.3.1 Orf疑似病料PCR检测结果
            2.3.2 ORFV感染牛睾丸上皮细胞的病变观察
            2.3.3 ORFV的 PCR检测结果
            2.3.4 菌液PCR结果
            2.3.5 PCR产物序列测定结果
            2.3.6 B2L基因的系统发育分析
            2.3.7 羊口疮病毒TCID50 测定结果
        2.4 讨论
        2.5 小结
    第三章 羊口疮病毒单抗杂交瘤细胞的IFA筛选与鉴定
        3.1 材料
            3.1.1 细胞株
            3.1.2 主要试剂
            3.1.3 主要仪器
            3.1.4 试剂配制
        3.2 方法
            3.2.1 杂交瘤细胞的复苏与传代
            3.2.2 间接免疫荧光法检测羊口疮病毒抗体方法的优化
            3.2.3 阳性杂交瘤细胞的筛选
            3.2.4 ORFV单克隆抗体类别鉴定
            3.2.5 Western blot检测
            3.2.6 组织冰冻切片的免疫荧光染色
        3.3 结果
            3.3.1 ORFV感染细胞培养样品的IFA检测时间优化结果
            3.3.2 ORFV接种滴度优化结果
            3.3.3 荧光二抗最适工作浓度优化结果
            3.3.4 ORFV单抗阳性杂交瘤细胞的筛选结果
            3.3.5 抗体类别鉴定结果
            3.3.6 ORFV的纯化
            3.3.7 Western blot鉴定
            3.3.8 组织中羊口疮病毒的间接免疫荧光检测
        3.4 讨论
        3.5 小结
结论
参考文献
致谢
个人简历


【参考文献】：
期刊论文
[1]羊口疮病毒环介导等温扩增高效检测方法的建立[J]. 王海峰,张七斤.  中国兽医学报. 2018(07)
[2]电子显微镜技术在羊口疮病毒研究中的应用进展[J]. 陈元翠,张益,鲜思美,李鹏飞,钱林,张友.  贵州畜牧兽医. 2018(02)
[3]羊口疮病毒感染MDBK细胞的电子显微镜观察[J]. 鲜思美,李鹏飞,李婷,顾丽群,陈元翠,刘宗胜,张习本.  黑龙江畜牧兽医. 2018(01)
[4]抗羊口疮病毒ORFV118蛋白单克隆抗体的制备、鉴定及其应用[J]. 肖斌,郝文波,杜政伦,廖小青,罗树红.  病毒学报. 2016(03)
[5]羊口疮病毒感染OFTu细胞的超微结构电镜观察[J]. 池雪林,曾显成,黄小红,罗树红,汪世华.  福建农林大学学报(自然科学版). 2015(01)
[6]羊口疮病毒B2L蛋白单克隆抗体的制备及鉴定[J]. 孔汉金,张克山,刘永杰,尚佑军,刘湘涛,吴斌.  中国兽医科学. 2014(07)
[7]羊口疮病毒干预宿主细胞泛素-蛋白酶体系统的分子机制[J]. 于永忠,佟春玉,宋佰芬,安红波,余丽芸,于力,崔玉东.  病毒学报. 2013(06)
[8]单克隆抗体间接免疫荧光检测猪瘟病毒方法的建立[J]. 许保疆,游一,郭成留,王川庆.  中国兽医学报. 2010(12)

硕士论文
[1]羊口疮病毒单克隆抗体的制备与鉴定[D]. 刘阿华.西北农林科技大学 2018
[2]青岛奥特奶山羊养殖场羊口疮病原学调查及灭活疫苗免疫效果评估[D]. 李星明.西北农林科技大学 2018
[3]宿主凋亡相关斑点样蛋白在羊口疮病毒致炎中的作用研究[D]. 张凯照.华南农业大学 2016
[4]羊口疮病毒和山羊痘病毒的分离鉴定及羊口疮病毒B2L蛋白单克隆抗体的研制[D]. 朱相儒.扬州大学 2016
[5]羊传染性脓疱病病毒胶体金快速诊断试纸条的研制[D]. 毕经影.吉林大学 2015
[6]羊口疮病毒重庆株的分离鉴定及其F1L基因原核表达研究[D]. 杨钰.贵州大学 2015
[7]羊口疮病毒的分离鉴定及B2L囊膜蛋白单克隆抗体的制备[D]. 谭强.黑龙江八一农垦大学 2014
[8]杨凌地区羊口疮流行病学调查、病毒分离鉴定及相关基因的生物信息学分析[D]. 刘方.西北农林科技大学 2014
[9]羊口疮病毒的分离鉴定及其ELISA检测方法的建立[D]. 张海瑞.中国农业科学院 2011



本文编号：3393792